囊泡相关膜蛋白VAPA调控牛病毒性腹泻病毒复制
囊泡相关膜蛋白VAPA调控牛病毒性腹泻病毒复制
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DOI：
10.13344/j.microbiol.china.210594
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发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
付强
中科院分区：
文献类型：
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作者：
史慧君;袁圆圆;郭妍婷;陈俊贞;杨莉;冉多良;付强
【背景】牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一，而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少，成为限制BVDV防控的重要原因。【目的】探明囊泡相关膜蛋白A (vesicle-associated membrane protein A，VAPA)对BVDV复制的影响。【方法】根据GenBank中VAPA基因，使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA (small guide RNA，sgRNA)，融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中，包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney，MDBK)后使用嘌呤霉素连续筛选5代，使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout，KO)情况；BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后，收集细胞提取总RNA，并将等质量的RNA反转录成cDNA，使用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR，RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay，IFA)分别检测BVDV 5′-非翻译区(untranslated region，UTR) mRNA水平和双链RNA (double strand RNA，dsRNA)积累水平，于BVDV感染后不同时间时观察致细胞病变(cytopathic effect，CPE)情况，并收集子代病毒液，使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化。接种等量VAPA KO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数检测VAPA KO是否影响细胞活性。【结果】慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选，Western Blot检测VAPA蛋白明显降低，成功获得VAPA KO细胞；与对照scramble细胞相比，BVDV感染VAPA KO细胞后5′-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低，BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻，子代病毒滴度在12 h和36 h显著下降，在48 h极显著下降；与scramble细胞相比，VAPA KO细胞活性未受影响。【结论】VAPA KO后显著性抑制BVDV复制，为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标。