鼠伤寒沙门菌未知功能蛋白STM14-0100晶体培养与酶活测定
鼠伤寒沙门菌未知功能蛋白STM14-0100晶体培养与酶活测定
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DOI：
10.13350/j.cjpb.220405
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发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
宋楠楠
中科院分区：
文献类型：
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作者：
李慧;李冰清;宋楠楠
目的克隆表达STM14-0100蛋白,纯化后培养蛋白晶体并测试蛋白酶活,为STM14-0100蛋白的结构与功能研究提供基础。方法采用生物信息学方法预测STM14-0100蛋白基本性质。构建STM14-0100-pGlO1重组质粒并诱导蛋白表达,层析纯化得到目的蛋白。通过晶体普筛找到适合蛋白晶体生长的条件并进行优化。收集单晶性良好的晶体进行X-射线衍射,数据采集用HKL2000软件处理。分别检测STM14-0100与突变体蛋白的酶活,然后加入梯度浓度的DTT和H_2O_2以观察氧化还原状态对蛋白酶活性的影响。结果预测STM14-0100蛋白第109和第165位氨基酸可能为活性中心内的关键位点。将重组表达质粒化到感受态细胞中,诱导表达蛋白,纯化后浓度为20 mg/mL。在含有0.04 mol/L Sodium cacodylate trihydrate pH7.0,50%v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pencanediol条件下,蛋白结晶晶型良好。经过X-射线衍射检测,得到一套分辨率为3.3A,完整性为94%的数据。STM14-0100蛋白有较强的硫酸酯酶活性,加入H_2O_2后其硫酸酯酶活性显著降低,而突变体蛋白STM14-0100-C109A则失去这两种酶的活性,突变体蛋白STM14-0100-H165A尚保留一定的酸性磷酸酯酶活性。结论STM14-0100蛋白可在原核表达体系中稳定表达,并培养出晶体。该蛋白具有硫酸酯酶活性,在氧化状态下酶活降低。突变第109位的半胱氨酸对酶的活性影响较大,推测该位点为位于酶活中心的关键氨基酸。