葡萄糖激酶的异源表达及葡萄糖激酶激动剂筛选体系的建立
葡萄糖激酶的异源表达及葡萄糖激酶激动剂筛选体系的建立
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DOI：
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发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
郝杰杰
中科院分区：
文献类型：
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作者：
张帅;程晓磊;刘曦;李琼;白董慧;于广利;郝杰杰
目的葡萄糖激酶(GK)是治疗Ⅱ型糖尿病的重要靶标。旨在通过原核表达获得人源GK,并建立葡萄糖激酶激动剂(GKAs)分子筛选体系,用于筛选靶向GK的抗Ⅱ型糖尿病先导化合物。方法采用基因重组的方法构建GK原核重组表达载体GK-pET28a,将其转化入感受态细胞BL21(DE3)中,采用IPTG诱导重组蛋白的表达,且对诱导条件进行优化。使用Ni-NTA对融合蛋白进行分离纯化。通过Western-blot鉴定蛋白且通过双酶偶联法对蛋白酶进行活力测试。建立葡萄糖激酶激动剂分子筛选体系,筛选活性化合物,并通过表面等离子共振技术(SPR)和计算机分子模拟技术探究活性化合物与葡萄糖激酶的结合情况。结果通过基因重组将葡萄糖激酶与pET28a原核表达载体构建成融合质粒,并且确定最佳诱导表达条件为:0.5 mmol·L~(–1),37 ℃,4~5 h。最佳纯化条件为:含10 mmol·L~(–1)咪唑缓冲液洗杂蛋白,含100 mmol·L~(–1)咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。通过Western-Blot鉴定表达的蛋白为目的蛋白,且蛋白酶具有较高的活力。成功建立GKAs分子筛选体系。利用SPR技术确定活性化合物与GK有较强的结合,并采用分子对接对其结合位点进行了预测。