通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株
通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株
复制标题
DOI：
10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003902
复制
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
廖瑛
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
翁文莲;宫晓倩;高波;方守国;王欢;钱琨;丁铲;廖瑛
传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）属于 γ属冠状病毒，其核酸内切酶 nsp15（Non‑structural protein 15）的功能尚未得到解析。为探讨 nsp15在 IBV 感染和复制过程中的作用，本研究对 nsp15的核酸内切酶活性中心 H238进行突变，通过体外连接技术构建重组病毒 rIBV‑nsp15‑H238A，并对病毒滴度、感染复制能力和生长曲线进行鉴定。方法如下：将 IBV Beaudette‑R 毒株的基因组分成 5 个片段克隆到质粒载体，并在每个片段加上BsaI或 BsmBI限制性酶切位点。通过质粒载体进行扩增后，通过酶切获得 cDNA 片段，在体外连接成全长基因组cDNA，转录出全长基因组 RNA，跟 N 的转录本一起电击转染到 Vero 细胞，拯救出重组病毒 rIBV 和 rIBV‑nsp15‑H238A。利用空斑试验检测比较 rIBV 和 rIBV‑nsp15‑H238A 的病毒滴度和空斑大小，鉴定 nsp15 核酸内切酶活性.对 IBV 感染性的影响。结果显示，rIBV‑nsp15‑H238A 的病毒滴度为 2.7×10 6 PFU/mL，比 rIBV 的病毒滴度（9.4×10 6 PFU/mL）低 3倍还多，且 rIBV‑nsp15‑H238A 空斑孔径远小于 rIBV，说明 rIBV‑nsp15‑H238A 复制和扩散能力远低于 rIBV。利用 TCID 50 检测病毒的生长曲线，结果表明在感染后 0~24h，rIBV‑nsp15‑H238A 的生长曲线均低于rIBV。由此可见，IBV nsp15H238核酸内切酶活性位点对 IBV 的感染复制起着重要作用。本研究通过反向遗传操.作构建 nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒，为研究 nsp15的功能提供了一个有力的工具。