三源重组H9N2禽流感病毒血凝素蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定
三源重组H9N2禽流感病毒血凝素蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定
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DOI：
10.13350/j.cjpb.230803
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发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
温峰
中科院分区：
文献类型：
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作者：
程晴;梁志鹏;何杰珩;池仕红;袁生;郭锦玥;黄淑坚;温峰
目的表达一株华南地区新发的三源重组H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)蛋白,并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR技术扩增华南地区分离的H9N2亚型AIV HA基因,并克隆至pET-32a载体。将重组pET-32a-HA质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定HA蛋白的表达,并优化诱导表达的IPTG浓度、时间及温度,提高表达效率。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过Western blot、间接免疫荧光和ELISA检测多克隆抗体的特异性和效价,采用HI试验测定其血凝抑制效价。结果PCR扩增出HA基因,大小约为1 700 bp。双酶切及测序结果表明,成功构建pET-32a-HA表达载体。经SDS-PAGE及Western blot验证该蛋白分子质量约79 ku,与预期一致,成功表达HA基因。对诱导条件进行优化,HA蛋白在28 ℃、IPTG终浓度为0.8 mmol/L诱导5 h表达量最高。制备的多克隆抗体可与HA蛋白特异性结合,其血凝抑制效价为1∶128,间接ELISA效价为1∶1 638 400。结论表达的pET-32a-HA蛋白具有免疫原性,制备的HA多克隆抗体具有良好特异性,且效价高,为建立ELISA检测方法及疫苗的研制奠定了基础。