PFunkel: efficient, expansive, user-defined mutagenesis.
PFunkel: efficient, expansive, user-defined mutagenesis.
复制标题
Pfunkel：高效，膨胀，用户定义的诱变。
DOI：
10.1371/journal.pone.0052031
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发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Ostermeier M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Firnberg E;Ostermeier M
我们介绍PFunkel，广泛的，研究人员定义的DNA诱变使用ssDNA或dsDNA模板的通用方法。一旦模板DNA被制备，该方法可以在单个管中在一天内完成，并且不需要中间DNA纯化或亚克隆。PFunkel可用于定点突变，效率接近100%。更重要的是，PFunkel使研究人员能够高效地构建用户定义的库。我们证明了在四个远端位点同时以70%的效率产生位点饱和的文库。我们还使用PFunkel创建TEM-1 β-内酰胺酶基因的综合密码子诱变文库。我们设计这个文库包含18，081个成员，每个成员对应于基因中每个可能的密码子替换（TEM-1中的287个位置x 63个可能的密码子替换）。深度测序显示，设计的单密码子取代中有97%存在于文库中。从这样的文库中，我们鉴定了18种以前未报道的适应性突变，每种突变都赋予对β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦的抗性。这些突变中的三个赋予等于或高于最耐药的TEM-1等位基因的耐药性，并有可能出现临床。
We introduce PFunkel, a versatile method for extensive, researcher-defined DNA mutagenesis using a ssDNA or dsDNA template. Once the template DNA is prepared, the method can be completed in a single day in a single tube, and requires no intermediate DNA purification or sub-cloning. PFunkel can be used for site-directed mutagenesis at an efficiency approaching 100%. More importantly, PFunkel allows researchers the unparalleled ability to efficiently construct user-defined libraries. We demonstrate the creation of a library with site-saturation at four distal sites simultaneously at 70% efficiency. We also employ PFunkel to create a comprehensive codon mutagenesis library of the TEM-1 ß-lactamase gene. We designed this library to contain 18,081 members, one for each possible codon substitution in the gene (287 positions in TEM-1 x 63 possible codon substitutions). Deep sequencing revealed that ∼97% of the designed single codon substitutions are present in the library. From such a library we identified 18 previously unreported adaptive mutations that each confer resistance to the ß-lactamase inhibitor tazobactam. Three of these mutations confer resistance equal to or higher than that of the most resistant reported TEM-1 allele and have the potential to emerge clinically.
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DOI：
10.1073/pnas.86.7.2172
发表时间：
1989-04-01
影响因子：
11.1
作者：
CHUNG, CT;NIEMELA, SL;MILLER, RH
通讯作者：
MILLER, RH
影响因子：
--
作者：
Denbigh, KG
通讯作者：
Denbigh, KG
影响因子：
2.4
作者：
Liu, Jia;Cropp, T. Ashton
通讯作者：
Cropp, T. Ashton
影响因子：
7
作者：
Giardine, B;Riemer, C;Nekrutenko, A
通讯作者：
Nekrutenko, A
DOI：
10.2174/1386207054867337
发表时间：
2005-09-01
影响因子：
1.8
作者：
Scholle, MD;Kehoe, JW;Kay, BK
通讯作者：
Kay, BK