Protein-retention expansion microscopy for visualizing subcellular organelles in fixed brain tissue.
Protein-retention expansion microscopy for visualizing subcellular organelles in fixed brain tissue.
复制标题
固定脑组织中亚细胞器的蛋白质保留扩张显微镜观察。
DOI：
10.1016/j.jneumeth.2021.109285
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发表时间：
2021-09-01
影响因子：
3
通讯作者：
Farris S
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Campbell LA;Pannoni KE;Savory NA;Lal D;Farris S
蛋白质膨胀显微镜(ProExM)是一种强大的技术，它将蛋白质交联到可膨胀的水凝胶上，以物理上膨胀和光学透明的生物样品。由此产生的更高的分辨率(~70 nm)和标记蛋白质的物理分离使其成为研究密集组织中亚细胞细胞器定位的一个有吸引力的工具，例如大脑。然而，消化和膨胀过程大大减少了荧光信号，因此有必要针对特定的最终目标优化每个样品的exm条件。在这里，我们比较现有proExM工作流的染色和消化条件，以确定在固定的小鼠脑组织中显示报告标记神经元中亚细胞细胞器(线粒体和高尔基体)的最佳方案。我们发现，在proExM之前的免疫染色和使用基于蛋白酶K的消化8小时，一致地导致免疫标记的亚细胞细胞器和基因编码的报告的强劲的荧光保持。使用这些方法，我们更准确地量化了线粒体的大小和数量，并更好地可视化了小鼠海马区CA2神经元中的高尔基体超微结构。这种细胞器优化的proExM协议将广泛适用于有兴趣可视化免疫标记的亚细胞细胞器在各种报告小鼠系中的空间分布的研究人员，减少优化过程中的工作量、时间和资源。
Protein expansion microscopy (proExM) is a powerful technique that crosslinks proteins to a swellable hydrogel to physically expand and optically clear biological samples. The resulting increased resolution (~70 nm) and physical separation of labeled proteins make it an attractive tool for studying the localization of subcellular organelles in densely packed tissues, such as the brain. However, the digestion and expansion process greatly reduce fluorescence signals making it necessary to optimize ExM conditions per sample for specific end goals. Here we compare the staining and digestion conditions of existing proExM workflows to identify the optimal protocol for visualizing subcellular organelles (mitochondria and the Golgi apparatus) within reporter-labeled neurons in fixed mouse brain tissue. We found that immunostaining before proExM and using a proteinase K based digestion for 8 hours consistently resulted in robust fluorescence retention for immunolabeled subcellular organelles and genetically-encoded reporters. With these methods, we more accurately quantified mitochondria size and number and better visualized Golgi ultrastructure in individual CA2 neurons in the mouse hippocampus. This organelle optimized proExM protocol will be broadly useful for investigators interested in visualizing the spatial distribution of immunolabeled subcellular organelles in various reporter mouse lines, reducing effort, time and resources on the optimization process.
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影响因子：
48
作者：
Chen F;Wassie AT;Cote AJ;Sinha A;Alon S;Asano S;Daugharthy ER;Chang JB;Marblestone A;Church GM;Raj A;Boyden ES
通讯作者：
Boyden ES
影响因子：
3.3
作者：
Jiang N;Kim HJ;Chozinski TJ;Azpurua JE;Eaton BA;Vaughan JC;Parrish JZ
通讯作者：
Parrish JZ
光学成像。膨胀显微镜。
DOI：
10.1126/science.1260088
发表时间：
2015-01-30
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Chen F;Tillberg PW;Boyden ES
通讯作者：
Boyden ES
影响因子：
5.5
作者：
Kunz, Tobias C.;Goetz, Ralph;Kozjak-Pavlovic, Vera
通讯作者：
Kozjak-Pavlovic, Vera
影响因子：
3.4
作者：
Cserép C;Pósfai B;Schwarcz AD;Dénes Á
通讯作者：
Dénes Á