Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry protocol for monitoring the progress of enzymatic (13)C/(15)N-labeled DNA syntheses.
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry protocol for monitoring the progress of enzymatic (13)C/(15)N-labeled DNA syntheses.
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用于监测酶促 (13)C/(15)N 标记 DNA 合成进度的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱方案。
DOI：
10.1016/j.ab.2005.04.008
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发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Yang,Danzhou
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ambrus,Attila;Chen,Ding;Whatcott,Clifford;Somogyi,Arpad;Yang,Danzhou
我们证明了一种简单的基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱协议提供了一种快速准确的方法来监测酶促DNA合成的阶段和完整性。这些合成的关键步骤是在所需的核苷酸长度处熄灭反应。这在昂贵的情况下尤其重要，例如，13C/ 15n标记的DNA片段被合成用于多核磁共振目的，以揭示详细的结构信息。分析了人类端粒22-mer、野生型和突变型人类c-MYC启动子（18-和22-mer） DNA的三个模板及其与DNA聚合酶I的3 ' - 5 ' exo - Klenow片段的反应，证明了我们的方案的有效性。在不同时间从反应混合物中提取少量样品（每个样品约为1-2μl），并采用板上连续脱盐方法进行MALDI- tof分析，消除了MALDI技术在高盐含量下的不敏感性。通过监测所需产物与引物-模板配合物对应离子的相对强度比来检测反应的进展。在成功的酶促反应中，nh3裂解导致最终产物的有效性也紧随MALDI-TOF。
We demonstrate that a simple matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry protocol provides a rapid and accurate method for monitoring the stage and completeness of enzymatic DNA syntheses. A crucial step of these syntheses is to quench the reaction at the desired nucleotide length. This is especially important when expensive, e.g.,13C/15N-labeled DNA segments, are synthesized for multinuclear magnetic resonance purposes to reveal detailed structural information. The analyses of three templates for a human telomeric 22-mer, a wild type, and a mutant human c-MYC promoter (18- and 22-mer) DNA and their reactions with the 3′–5′ exo−Klenow fragment of DNA polymerase I demonstrate the usefulness of our protocol. Small amounts of samples (ca. 1–2μl each) were taken from the reaction mixtures at different times and analyzed promptly by MALDI-TOF, applying our successive on-plate desalting method that eliminates the insensitivity of the MALDI technique at high salt content. The progress of the reaction was detected by monitoring the relative intensity ratios of ions corresponding to the desired products and the primer–template complexes. The effectiveness of NH3cleavage leading to final products was also followed by MALDI-TOF in successful enzymatic reactions.
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用于从聚丙烯酰胺凝胶中回收寡脱氧核苷酸的改良压碎和浸泡方法。
影响因子：
2.7
作者：
Chen,Z;Ruffner,DE
通讯作者：
Ruffner,DE
DOI：
10.1073/pnas.92.8.3091
发表时间：
1995-04
影响因子：
11.1
作者：
D. Zimmer;D. Crothers
通讯作者：
D. Zimmer;D. Crothers
影响因子：
5.6
作者：
Kettani, A;Gorin, A;Patel, DJ
通讯作者：
Patel, DJ
影响因子：
14.9
作者：
Kirpekar, F;Nordhoff, E;Hillenkamp, F
通讯作者：
Hillenkamp, F
影响因子：
2.9
作者：
Ambrus, A;Chen, D;Yang, DZ
通讯作者：
Yang, DZ