High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins.
High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins.
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DOI：
10.1016/j.ymeth.2019.07.021
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发表时间：
2019-10-01
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Michalet X
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Segal M;Ingargiola A;Lerner E;Chung S;White JA;Streets A;Weiss S;Michalet X
单分子Förster共振能量转移（smFRET）是纳米尺度单分子研究的有力技术。特别是基于溶液的smFRET，可以用来研究生物相关条件下的平衡分子内和分子间构象、结合/解结合事件和构象变化，而不需要集合平均。然而，溶液中的单点smFRET测量速度很慢。在这里，我们详细介绍了一种高通量smFRET方法，该方法将传统的单点共聚焦几何形状扩展到多点共聚焦几何形状。激发点被光学共轭到两个定制的硅单光子雪崩二极管（SPAD）阵列上。双色激发是实现使用周期性受体激发（PAX），允许区分单和双标记分子。我们展示了这种设置的能力，通过汇集从多个点独立收集的数据，快速准确地确定FRET效率和种群化学计量学。我们还展示了这种方法的高通量如何用于增加单分子FRET种群表征的时间分辨率，从几分钟到几秒钟。结合微流体，这种高通量方法将使简单的实时动力学研究以及强大的分子筛选应用成为可能。
Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) is a powerful technique for nanometer-scale studies of single molecules. Solution-based smFRET, in particular, can be used to study equilibrium intra- and intermolecular conformations, binding/unbinding events and conformational changes under biologically relevant conditions without ensemble averaging. However, single-spot smFRET measurements in solution are slow. Here, we detail a high-throughput smFRET approach that extends the traditional single-spot confocal geometry to a multispot one. The excitation spots are optically conjugated to two custom silicon single photon avalanche diode (SPAD) arrays. Two-color excitation is implemented using a periodic acceptor excitation (PAX), allowing distinguishing between singly- and doubly-labeled molecules. We demonstrate the ability of this setup to rapidly and accurately determine FRET efficiencies and population stoichiometries by pooling the data collected independently from the multiple spots. We also show how the high throughput of this approach can be used to increase the temporal resolution of single-molecule FRET population characterization from minutes to seconds. Combined with microfluidics, this high-throughput approach will enable simple real-time kinetic studies as well as powerful molecular screening applications.
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DOI：
10.1073/pnas.95.4.1556
发表时间：
1998-02-17
影响因子：
11.1
作者：
Eggeling, C;Fries, JR;Seidel, CAM
通讯作者：
Seidel, CAM
影响因子：
1.6
作者：
Dufresne, ER;Spalding, GC;Grier, DG
通讯作者：
Grier, DG
影响因子：
2.9
作者：
Fries, JR;Brand, L;Seidel, CAM
通讯作者：
Seidel, CAM
DOI：
10.1007/s00249-007-0133-7
发表时间：
2007-07-01
影响因子：
2
作者：
Doose, Soren;Heilemann, Mike;Kapanidis, Achillefs N.
通讯作者：
Kapanidis, Achillefs N.
影响因子：
3.8
作者：
Cohen, Adam E.;Moerner, W. E.
通讯作者：
Moerner, W. E.