Development of a sensitive microplate assay for characterizing RNA methyltransferase activity: Implications for epitranscriptomics and drug development.
Development of a sensitive microplate assay for characterizing RNA methyltransferase activity: Implications for epitranscriptomics and drug development.
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DOI：
10.1016/j.jbc.2023.105257
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发表时间：
2023-10
影响因子：
4.8
通讯作者：
Gowher, Humaira
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Mensah, Isaiah K.;Norvil, Allison B.;He, Ming;Lendy, Emma;Hjortland, Nicole;Tan, Hern;Pomerantz, Richard T.;Mesecar, Andrew;Gowher, Humaira
RNA 甲基化是多种 RNA 类别中普遍存在的转录后修饰，是基因表达的关键调节因子。在这项研究中，我们使用寨卡病毒 RNA 甲基转移酶 (MTase) 开发了一种高度灵敏的微孔板测定法，该测定法使用生物素化的 RNA 底物和放射性标记的 AdoMet 辅酶。该测定快速、重复性高，在多种周转条件下表现出线性进展曲线动力学，在竞争性抑制测定中具有高灵敏度，并且与目前使用的方法相比背景水平显着降低。使用我们新开发的微孔板测定法，我们观察到全长非结构蛋白 5 酶和截短的 MTase 结构域的催化常数没有显着差异。这些数据表明，与寨卡病毒RNA依赖性RNA聚合酶活性不同，MTase活性不受RNA依赖性RNA聚合酶-MTase域间相互作用的影响。鉴于其定量性质和准确性，该方法可用于表征各种 RNA MTase，因此对表观转录组学和针对传染病的药物开发领域做出了重大贡献。
RNA methylation is a ubiquitous post-transcriptional modification found in diverse RNA classes and is a critical regulator of gene expression. In this study, we used Zika virus RNA methyltransferase (MTase) to develop a highly sensitive microplate assay that uses a biotinylated RNA substrate and radiolabeled AdoMet coenzyme. The assay is fast, highly reproducible, exhibits linear progress-curve kinetics under multiple turnover conditions, has high sensitivity in competitive inhibition assays, and significantly lower background levels compared with the currently used method. Using our newly developed microplate assay, we observed no significant difference in the catalytic constants of the full-length nonstructural protein 5 enzyme and the truncated MTase domain. These data suggest that, unlike the Zika virus RNA-dependent RNA polymerase activity, the MTase activity is unaffected by RNA-dependent RNA polymerase–MTase interdomain interaction. Given its quantitative nature and accuracy, this method can be used to characterize various RNA MTases, and, therefore, significantly contribute to the field of epitranscriptomics and drug development against infectious diseases.
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