Efficient production of Japanese encephalitis virus-like particles by recombinant lepidopteran insect cells
Efficient production of Japanese encephalitis virus-like particles by recombinant lepidopteran insect cells
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重组鳞翅目昆虫细胞高效生产日本脑炎病毒样颗粒
DOI：
10.1007/s00253-012-4371-y
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发表时间：
2013
影响因子：
5
通讯作者：
Eiji Konishi
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hideki Yamaji;Masataka Nakamura;Miwa Kuwahara;Yusuke Takahashi;Tomohisa Katsuda;Eiji Konishi
研究了稳定转化鳞翅目昆虫细胞中乙脑病毒样颗粒（VLPs）的产生。将编码乙脑病毒（JEV） prM信号肽、病毒膜蛋白(M)前体（prM）和包膜糖蛋白(E)的DNA片段克隆到质粒载体pIHAbla中。pIHAbla在b的下游含有家蚕促动蛋白启动子。核多角体病毒（BmNPV） IE-1转录激活子和BmNPV HR3增强子的高水平表达，以及一个囊胚杀虫素抗性基因作为选择性标记。编码一种pr/M切割位点突变的prM形式的DNA被用来抑制VLPs的细胞融合活性。质粒转染后，将niBTI-TN-5B1-4 (High Five) Trichoplusia niBTI-TN-5B1-4细胞与blasticidin孵育，获得耐药细胞。Western blot分析和酶联免疫吸附实验表明，转染的High Five细胞分泌的E抗原与真JEV E相当。蔗糖密度梯度沉降分析重组High Five细胞的培养上清表明，分泌的E抗原分子以颗粒形式产生。从上清中回收的VLPs成功地诱导了小鼠的中和抗体，特别是当被吸附到明矾佐剂上时。摇瓶培养E抗原的产率高（≈30 μg/ml）。这些结果表明，重组昆虫细胞可能为高效生产VLP提供了一种新的途径。
The production of Japanese encephalitis (JE) virus-like particles (VLPs) in stably transformed lepidopteran insect cells was investigated. The DNA fragment encoding the JE virus (JEV) prM signal peptide, the precursor (prM) of the viral membrane protein (M), and the envelope glycoprotein (E) was cloned into the plasmid vector pIHAbla. The pIHAbla contained theBombyx moriactin promoter downstream of theB. morinucleopolyhedrovirus (BmNPV) IE-1 transactivator and the BmNPV HR3 enhancer for high-level expression, together with a blasticidin resistance gene for use as a selectable marker. DNA encoding a form of prM with a pr/M cleavage site mutation was used to suppress the cell-fusion activity of VLPs. After transfection with the resultant plasmid,Trichoplusia niBTI-TN-5B1-4 (High Five) cells were incubated with blasticidin, and cells resistant to the antibiotic were obtained. Western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay of a culture supernatant showed that transfected High Five cells secreted an E antigen equivalent to the authentic JEV E. Sucrose density-gradient sedimentation analysis of the culture supernatant from recombinant High Five cells indicated that secreted E antigen molecules were produced in a particulate form. VLPs recovered from the supernatant successfully induced neutralizing antibodies in mice, particularly when adsorbed to alum adjuvant. High yields (≈30 μg/ml) of E antigen were achieved in shake-flask cultures. These results indicate that recombinant insect cells may offer a novel approach for efficient VLP production.
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