Development of an AP-FRET based analysis for characterizing RNA-protein interactions in myotonic dystrophy (DM1).
Development of an AP-FRET based analysis for characterizing RNA-protein interactions in myotonic dystrophy (DM1).
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DOI：
10.1371/journal.pone.0095957
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发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Mahadevan MS
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Rehman S;Gladman JT;Periasamy A;Sun Y;Mahadevan MS
福斯特共振能量转移 (FRET) 显微镜是一种强大的工具，用于利用从激发态的供体荧光团到附近的受体荧光团的非辐射能量转移来识别活细胞或固定细胞中的分子相互作用。 FRET 是研究蛋白质-蛋白质和/或蛋白质-核酸相互作用的非常灵敏的工具。 RNA 毒性与许多疾病有关；尤其是那些与重复序列扩大相关的疾病，例如强直性肌营养不良。强直性肌营养不良 (DM1) 是由 DMPK 基因 3' UTR 中的 (CTG)n 重复扩增引起的，导致突变 DMPK 转录本保留在 RNA 病灶中的核内。这会导致通过 RNA 结合蛋白（例如 MBNL1、hnRNPH、CUGBP1）功能改变介导的毒性功能获得效应。在这项研究中，我们展示了一种新的受体光漂白测定法测量 RNA 和蛋白质之间的 FRET (AP-FRET) 的潜力。我们选择关注 DM1 患者细胞中 MBNL1 和突变 DMPK mRNA 之间的相互作用，因为它们共定位的有力微观证据。使用该技术，我们获得了 MBNL1 和 DMPK RNA 之间细胞内相互作用的直接证据。此外，使用 AP-FRET 测定和 MBNL1 突变体，我们表明 MBNL1 中的所有四个锌指基序对于 MBNL1-RNA 焦点相互作用至关重要。使用这种新测定法获得的数据为 RNA 结合蛋白和 RNA 焦点之间的相互作用提供了令人信服的证据，并为 MBNL1-RNA 焦点相互作用的机制提供了见解，证明了 AP-FRET 在检查 DM1 中 RNA-蛋白质相互作用方面的能力。
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy is a powerful tool used to identify molecular interactions in live or fixed cells using a non-radiative transfer of energy from a donor fluorophore in the excited state to an acceptor fluorophore in close proximity. FRET can be a very sensitive tool to study protein-protein and/or protein-nucleic acids interactions. RNA toxicity is implicated in a number of disorders; especially those associated with expanded repeat sequences, such as myotonic dystrophy. Myotonic dystrophy (DM1) is caused by a (CTG)n repeat expansion in the 3′ UTR of the DMPK gene which results in nuclear retention of mutant DMPK transcripts in RNA foci. This results in toxic gain-of-function effects mediated through altered functions of RNA-binding proteins (e.g. MBNL1, hnRNPH, CUGBP1). In this study we demonstrate the potential of a new acceptor photobleaching assay to measure FRET (AP-FRET) between RNA and protein. We chose to focus on the interaction between MBNL1 and mutant DMPK mRNA in cells from DM1 patients due to the strong microscopic evidence of their co-localization. Using this technique we have direct evidence of intracellular interaction between MBNL1 and the DMPK RNA. Furthermore using the AP-FRET assay and MBNL1 mutants, we show that all four zinc-finger motifs in MBNL1 are crucial for MBNL1-RNA foci interactions. The data derived using this new assay provides compelling evidence for the interaction between RNA binding proteins and RNA foci, and mechanistic insights into MBNL1-RNA foci interaction demonstrating the power of AP-FRET in examining RNA-Protein interactions in DM1.
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作者：
Kino, Yoshihiro;Washizu, Chika;Ishiura, Shoichi
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Ishiura, Shoichi
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作者：
Miller, JW;Urbinati, CR;Swanson, MS
通讯作者：
Swanson, MS
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作者：
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通讯作者：
KORNELUK, RG
DOI：
10.1073/pnas.0708519105
发表时间：
2008-02-19
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作者：
Orengo, James P.;Chambon, Pierre;Cooper, Thomas A.
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作者：
Kenworthy, AK
通讯作者：
Kenworthy, AK