A versatile mass spectrometry-based method to both identify kinase client-relationships and characterize signaling network topology.
A versatile mass spectrometry-based method to both identify kinase client-relationships and characterize signaling network topology.
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DOI：
10.1021/pr3009995
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发表时间：
2013-02-01
影响因子：
4.4
通讯作者：
Thelen JJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ahsan N;Huang Y;Tovar-Mendez A;Swatek KN;Zhang J;Miernyk JA;Xu D;Thelen JJ
虽然在拟南芥基因组中已鉴定出一千多种蛋白激酶 (PK)，但在鉴定其单个客户蛋白方面取得的进展相对较小。在此，我们描述了使用基于质谱的体外磷酸化策略（称为激酶客户端测定（KiC 测定））来研究信号传导的靶向方面。使用 71 个重组拟南芥 PK 筛选包含来自发育种子的 377 个体内磷酸化序列的合成肽文库。在初步结果中，我们确定了 23 种蛋白质作为 17 种 PK 的推定客户。在一种情况下，蛋白磷酸酶抑制剂 2 (AtPPI-2) 被三种不同的 PK、酪蛋白激酶 1 样 10、AME3 和 Ser PK 样蛋白在多个位点磷酸化。为了证实这一结果，用这些 PK 中的每一个重建全长重组 AtPPI-2。结果证实了该蛋白质内有多个不同的磷酸化位点。生化分析表明 AtPPI-2 抑制 1 型蛋白磷酸酶 (TOPP) 活性，并且 AtPPI-2 的磷酸化形式是更有效的抑制剂。结构模型显示 AtPPI-2 的磷酸化会诱导构象变化，从而调节 TOPP 结合。
While more than a thousand protein kinases (PK) have been identified in the Arabidopsis thaliana genome, relatively little progress has been made towards identifying their individual client proteins. Herein we describe the use of a mass spectrometry-based in vitro phosphorylation strategy, termed Kinase Client assay (KiC assay), to study a targeted-aspect of signaling. A synthetic peptide library comprising 377 in vivo phosphorylation sequences from developing seed was screened using 71 recombinant A. thaliana PK. Among the initial results, we identified 23 proteins as putative clients of 17 PK. In one instance protein phosphatase inhibitor-2 (AtPPI-2) was phosphorylated at multiple-sites by three distinct PK, casein kinase 1-like 10, AME3, and a Ser PK-like protein. To confirm this result, full-length recombinant AtPPI-2 was reconstituted with each of these PK. The results confirmed multiple distinct phosphorylation sites within this protein. Biochemical analyses indicate that AtPPI-2 inhibits type 1 protein phosphatase (TOPP) activity, and that the phosphorylated forms of AtPPI-2 are more potent inhibitors. Structural modeling revealed that phosphorylation of AtPPI-2 induces conformational changes that modulate TOPP binding.
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影响因子：
5.6
作者：
Ahsan, Nagib;Swatek, Kirby N.;Thelen, Jay J.
通讯作者：
Thelen, Jay J.
DOI：
10.1073/pnas.100460897
发表时间：
2000-05-23
影响因子：
11.1
作者：
Huang, KX;Paudel, HK
通讯作者：
Paudel, HK
影响因子：
7.4
作者：
Chen, Mingjie;Mooney, Brian P.;Thelen, Jay J.
通讯作者：
Thelen, Jay J.
影响因子：
4.8
作者：
Hurley, Thomas D.;Yang, Jie;DePaoli-Roach, Anna A.
通讯作者：
DePaoli-Roach, Anna A.
影响因子：
7.4
作者：
Meyer, Louis J.;Gao, Jianjiong;Thelen, Jay J.
通讯作者：
Thelen, Jay J.