PCR-directed formation of viral hybrids in vitro.
PCR-directed formation of viral hybrids in vitro.
复制标题
PCR 指导的体外病毒杂交体的形成。
DOI：
10.1006/viro.1996.8328
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发表时间：
1997
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Serwer,P
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Khan,SA;Watson,RH;Hayes,SJ;Serwer,P
当构建具有所需杂交表型的病毒时，预期的困难包括许多（可能是大多数）可通过掺入 DNA 片段构建的杂交基因组无法生存。因此，可能必须构建许多不同的混合基因组才能找到可行的基因组。为了在单个实验中进行这项组合工作，我们使用了噬菌体 T7 感染的细胞提取物在体外转移 DNA。在提取物中，我们孵育了 T7 DNA，以及通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增 T7 相关噬菌体 T3 尾纤维的基因（基因 17）获得的 DNA。体外包装提取物中的 DNA 后，通过 T3 特异性寡核苷酸探测来检测杂交子代噬菌体；混合体的出现频率为 0.1%。通过测定14个独立分离的杂交体的整个基因17的核苷酸序列，发现在所有杂交体中PCR片段的右端和左端均被截短。对于所有 14 个混合体，右端位于同一位置；左端位于 3 个不同的位置。末端的非随机位置可以通过选择不同的插入片段来解释活力；也就是说，大多数杂交基因组是无法生存的。一些杂交体从 T3 获得了在琼脂糖凝胶电泳期间不粘附琼脂糖凝胶的理想表型。
When constructing viruses that have desired hybrid phenotypes, anticipated difficulties include the nonviability of many, possibly most, of the hybrid genomes that can be constructed by incorporation of DNA fragments. Therefore, many different hybrid genomes may have to be constructed in order to find one that is viable. To perform this combinatorial work in a single experiment, we have used bacteriophage T7-infected cell extracts to transfer DNAin vitro.In an extract, we have incubated T7 DNA, together with DNA obtained by polymerase chain reaction (PCR) amplification of the gene (gene 17) for the tail fiber of the T7-related bacteriophage, T3. Afterin vitropackaging of DNA in the extract, hybrid progeny bacteriophage were detected by probing with a T3-specific oligonucleotide; hybrids are found at a frequency of 0.1%. By determination of the nucleotide sequence of the entire gene 17 of 14 independently isolated hybrids, both right and left ends of the PCR fragment are found to be truncated in all hybrids. For all 14 hybrids, the right end is in the same location; the left end is found at 3 different locations. The nonrandom location of the ends is explained by selection among different inserts for viability; that is, most of the hybrid genomes are nonviable. Some hybrids acquire from T3 the desirable phenotype of nonadherence to agarose gels during agarose gel electrophoresis.
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