Characterization of SARS main protease and inhibitor assay using a fluorogenic substrate.
Characterization of SARS main protease and inhibitor assay using a fluorogenic substrate.
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DOI：
10.1016/j.bbrc.2004.04.098
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发表时间：
2004-06-11
影响因子：
3.1
通讯作者：
Liang PH
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kuo CJ;Chi YH;Hsu JT;Liang PH
SARS主要蛋白水解酶是SARS冠状病毒生命周期所必需的，可能是开发抗SARS药物的关键靶点。最近，在大肠杆菌中表达的酶被用高效液相色谱方法鉴定，以监测覆盖SARS病毒基因组中发现的裂解位点的11个肽底物的产物的形成。该酶易解离为失活单体，二聚体的解离常数为100gμM。为了检测酶的活性，需要在微摩尔酶浓度下进行测定。这使得寻找紧密的抑制剂(纳摩尔范围IC50)是不可能的。在这项研究中，我们制备了一个在多肽底物两端带有荧光猝灭对(Dabcyl和Edans)的多肽，并用这个荧光肽底物来鉴定SARS主要的蛋白酶和筛选抑制剂。该荧光肽在被该酶催化裂解时给出了非常灵敏的信号。使用该底物，该酶的活性(kcat=1.9kcat S−1，km=17μM)明显高于以前报道的参数。在我们的测定条件下，该酶以活性二聚体的形式存在，不解离为单体，并显示出较小的Kd值(15nM)。这种酶与荧光肽底物相结合，为我们提供了一种合适的工具来鉴定有效的SARS蛋白酶抑制剂。
SARS main protease is essential for life cycle of SARS coronavirus and may be a key target for developing anti-SARS drugs. Recently, the enzyme expressed in Escherichia coli was characterized using a HPLC assay to monitor the formation of products from 11 peptide substrates covering the cleavage sites found in the SARS viral genome. This protease easily dissociated into inactive monomer and the deduced Kd of the dimer was 100 μM. In order to detect enzyme activity, the assay needed to be performed at micromolar enzyme concentration. This makes finding the tight inhibitor (nanomolar range IC50) impossible. In this study, we prepared a peptide with fluorescence quenching pair (Dabcyl and Edans) at both ends of a peptide substrate and used this fluorogenic peptide substrate to characterize SARS main protease and screen inhibitors. The fluorogenic peptide gave extremely sensitive signal upon cleavage catalyzed by the protease. Using this substrate, the protease exhibits a significantly higher activity (kcat=1.9 s−1 and Km=17 μM) compared to the previously reported parameters. Under our assay condition, the enzyme stays as an active dimer without dissociating into monomer and reveals a small Kd value (15 nM). This enzyme in conjunction with fluorogenic peptide substrate provides us a suitable tool for identifying potent inhibitors of SARS protease.
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作者：
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通讯作者：
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DOI：
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发表时间：
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Peiris JS;Lai ST;Poon LL;Guan Y;Yam LY;Lim W;Nicholls J;Yee WK;Yan WW;Cheung MT;Cheng VC;Chan KH;Tsang DN;Yung RW;Ng TK;Yuen KY;SARS study group
通讯作者：
SARS study group
DOI：
10.1074/jbc.m310875200
发表时间：
2004-01-16
期刊：
The Journal of biological chemistry
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--
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