Kinetics of proton-linked flavin conformational changes in p-hydroxybenzoate hydroxylase.
Kinetics of proton-linked flavin conformational changes in p-hydroxybenzoate hydroxylase.
复制标题
对羟基苯甲酸羟化酶中质子连接的黄素构象变化的动力学。
DOI：
10.1021/bi051119t
复制
发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Palfey,BruceA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Frederick,KendraKing;Palfey,BruceA
对羟基苯甲酸羟化酶 (PHBH) 是一种 FAD 依赖性单加氧酶，在 NADPH 依赖性反应中催化对羟基苯甲酸 (pOHB) 羟基化为 3,4-二羟基苯甲酸。两个结构特征耦合起来控制 PHBH 与 NADPH 的反应性： 质子转移网络允许质子在隔离的活性位点和溶剂之间传递，黄素采用两个位置： “in”，黄素靠近 pOHB，“out”，黄素靠近 NADPH。 PHBH 使用质子转移网络来测试是否存在合适的芳香底物，然后让黄素采用 NADPH 可接近的构象。在这项工作中，对具有破坏的质子转移网络的 His72Asn 突变体的动力学分析表明，在存在或不存在 NADPH 的情况下都可能发生黄素运动，但 NADPH 会刺激向氢化物转移所需的反应构象的运动。底物和溶剂同位素对 His72Asn 突变体还原瞬时动力学的影响表明，质子转移与黄素运动相关，并且构象变化发生在与氢化物转移分开的步骤中。通过在非缓冲溶液中存在荧光 pH 指示剂染料的情况下进行实验，可以直接在野生型酶中观察到还原半反应期间的质子转移。 NADPH 结合导致酶快速释放质子，然后在黄素还原后吸收质子。溶剂和底物动力学同位素效应表明，质子耦合黄素运动和还原也发生在野生型 PHBH 的不同步骤中。这些结果允许为野生型酶的还原半反应提出详细的动力学方案。附录中分析了底物诱导异构化的三种动力学模型。
p-Hydroxybenzoate hydroxylase (PHBH) is an FAD-dependent monooxygenase that catalyzes the hydroxylation ofp-hydroxybenzoate (pOHB) to 3,4-dihydroxybenzoate in an NADPH-dependent reaction. Two structural features are coupled to control the reactivity of PHBH with NADPH: a proton-transfer network that allows protons to be passed between the sequestered active site and solvent and a flavin that adopts two positions: “in”, where the flavin is near pOHB, and “out”, where the flavin is near NADPH. PHBH uses the proton-transfer network to test for the presence of a suitable aromatic substrate before allowing the flavin to adopt the NADPH-accessible conformation. In this work, kinetic analysis of the His72Asn mutant, with a disrupted proton-transfer network, showed that flavin movement could occur in the presence or absence of NADPH but that NADPH stimulated movement to the reactive conformation required for hydride transfer. Substrate and solvent isotope effects on the transient kinetics of reduction of the His72Asn mutant showed that proton transfer was linked to flavin movement and that the conformational change occurred in a step separate from that of hydride transfer. Proton transfers during the reductive half-reaction were observed directly in the wild-type enzyme by performing experiments in the presence of a fluorescent pH-indicator dye in unbuffered solutions. NADPH binding caused rapid proton release from the enzyme, followed by proton uptake after flavin reduction. Solvent and substrate kinetic isotope effects showed that proton-coupled flavin movement and reduction also occurred in different steps in wild-type PHBH. These results allow a detailed kinetic scheme to be proposed for the reductive half-reaction of the wild-type enzyme. Three kinetic models considered for substrate-induced isomerization are analyzed in the Appendix.
登录
查看更多内容
荧光假单胞菌对羟基苯甲酸羟化酶和恶臭假单胞菌水杨酸羟化酶的 NMR 研究。
DOI：
--
发表时间：
1991
期刊：
European Journal of Biochemistry
影响因子：
--
作者：
J. Vervoort;W. V. Berkel;Franz Müller;C. Moonen
通讯作者：
C. Moonen
被 6-叠氮基和 6-氨基黄素腺嘌呤二核苷酸取代的对羟基苯甲酸羟化酶催化循环中的黄素构象变化。
DOI：
10.1021/bi971427u
发表时间：
1997
期刊：
Biochemistry.
影响因子：
--
作者：
Palfey,BA;Ballou,DP;Massey,V
通讯作者：
Massey,V
一种在快速平衡假设或平衡与稳态组合假设下推导酶催化反应速率方程的简单方法。
影响因子：
4.8
作者：
S. Cha
通讯作者：
S. Cha
对羟基苯甲酸羟化酶反应的动力学研究。
影响因子：
4.8
作者：
M. Husain;V. Massey
通讯作者：
V. Massey
二氢二磷酸吡啶核苷酸中电子能的分子内转移
影响因子：
64.8
作者：
G. Weber
通讯作者：
G. Weber