Stepwise partially overlapping primer-based PCR for genome walking.
Stepwise partially overlapping primer-based PCR for genome walking.
复制标题
用于基因组步移的基于引物的逐步部分重叠 PCR
DOI：
10.1186/s13568-018-0610-7
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发表时间：
2018-05-09
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Li H
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chang K;Wang Q;Shi X;Wang S;Wu H;Nie L;Li H
建立了一种基于部分重叠引物的逐步PCR（SWPOP-PCR）方法，该方法包括3轮由SWPOP引物-巢式特异性引物对依次驱动的巢式PCR。SWPOP引物组的特点是有10 bp的部分重叠，后者的3′-部分与前者的5′-部分相同，这使得使用中的SWPOP引物只能在相对较低的温度下与先前PCR产物的SWPOP位点退火。对于每个PCR，在唯一的一个低严格性循环中由SWPOP引物引发的靶单链DNA在随后的高严格性循环中转化为双链形式，这是由于存在特异性引物的完美退火位点。该由特异性引物和SWPOP引物结合的双链DNA在剩余的高严格循环中以指数方式扩增。然而，由于任何引物都缺乏完美的互补序列，因此不能扩增非靶单链DNA。因此，SWPOP引物组的部分重叠优先合成靶产物，但抑制非特异性扩增。利用SWPOP-PCR技术成功地获得了短乳杆菌NCL 912谷氨酸脱羧酶基因（gadA）和水稻潮霉素基因（hyg）的侧翼序列。
A stepwise partially overlapping primer-based PCR (SWPOP-PCR) method for isolating flanking unknown DNA regions was developed, which comprises three rounds of nested PCRs sequentially driven by SWPOP primer-nested specific primer pairs. SWPOP primer set is characterized by a partial overlap of 10 bp with 3′-part of the latter primer is identical to 5′-part of the former one, which makes the SWPOP primer in use anneal to SWPOP site of the prior PCR product only at relatively low temperature. For each PCR, target single-stranded DNA primed by the SWPOP primer in the exclusive one low-stringency cycle is converted into double-stranded form in the following high-stringency cycle due to the presence of a perfect annealing site for the specific primer. This double-stranded DNA bounded by the specific primer and the SWPOP primer is exponentially amplified in the remaining high-stringency cycles. Non-target single-stranded DNA, however, cannot be amplified given the lack of perfect complementary sequences for any primers. Therefore, the partial overlap of a SWPOP primer set preferentially synthesizes target products but inhibits nonspecific amplification. We successfully exploited SWPOP-PCR to obtain the DNA sequences flanking glutamate decarboxylase gene (gadA) locus inLactobacillus brevisNCL912 and hygromycin gene (hyg) integrated in rice.
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