Conformational studies on Arabidopsis sulfurtransferase AtStr1 with spectroscopic methods
Conformational studies on Arabidopsis sulfurtransferase AtStr1 with spectroscopic methods
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拟南芥硫转移酶AtStr1的光谱法构象研究
作者：
A. Bartels;F. Forlani;S. Pagani;J. Papenbrock
摘要 硫转移酶/硫氰酸酶（Str）是广泛分布于古细菌、原核生物和真核生物中的酶，催化硫从供体分子转移到亲硫性受体底物。在此反应中，Str 在无硫和硫取代形式之间循环。双结构域 Str 由两个大小和构象几乎相同的球状结构域组成，通过短连接序列连接，与其他生物体中的 Str 相比，植物双结构域 Str 蛋白中的连接序列延长。双结构域拟南芥 Str1 蛋白 (At1g79230) 在大肠杆菌中表达为成熟蛋白、无延长接头序列的变体以及 AtStr1C332S 和 AtStr1C339V。通过荧光光谱法研究了存在和不存在硫供体时纯化的重组蛋白的过硫化状态。在远紫外范围内通过圆二色性 (CD) 分析二级结构，而在近紫外范围内通过 CD 确定三级结构的总体变化。最后，通过胰蛋白酶消化分析蛋白质稳定性。延长的接头序列对于正确的构象和稳定性至关重要，从而影响 AtStr1 的催化活性。催化半胱氨酸残基 C332 的替换导致分子具有更高的刚性，而 C339 的替换不会导致任何构象变化，这提供了 C339 直接参与催化作用的证据。
Abstract Sulfurtransferases/rhodaneses (Str) are enzymes widely distributed in archaea, prokaryota and eukaryota, and catalyze the transfer of sulfur from a donor molecule to a thiophilic acceptor substrate. In this reaction, Str cycles between the sulfur-free and the sulfur-substituted form. Two-domain Str consist of two globular domains of nearly identical size and conformation connected by a short linker sequence, which is elongated in plant two-domain Str proteins compared to Str in other organisms. The two-domain Arabidopsis thaliana Str1 protein (At1g79230) was expressed in Escherichia coli as a mature protein, as a variant without the elongated linker sequence, and as AtStr1C332S and AtStr1C339V. The persulfuration state of the purified recombinant proteins was investigated in the presence and absence of sulfur donors by fluorescence spectroscopy. The secondary structure was analyzed by circular dichroism (CD) in the far-UV range, while overall changes in tertiary structure were determined by CD in the near-UV range. Finally, protein stability was analyzed by tryptic digestion. The elongated linker sequence is essential for correct conformation and stability, and thereby affects the catalytic activity of AtStr1. Replacement of the catalytic cysteine residue C332 leads to higher rigidity of the molecule, whereas replacement of C339 does not lead to any conformational changes, providing evidence of the direct involvement of C339 in catalysis.
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非催化性巯基突变会影响硫氰酸酶的稳定性、折叠和氧化敏感性。
DOI：
--
发表时间：
1994
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
Miller-Martini,DM;Chirgwin,JM;Horowitz,PM
通讯作者：
Horowitz,PM
使用内在蛋白质荧光来定量酶结合的过硫化物并测量硫氰酸催化中间体之间的平衡。
DOI：
--
发表时间：
1983
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
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通讯作者：
Criscimagna,NL
域间系链的突变影响硫氰酸酶的稳定性和重折叠。
DOI：
10.1016/0167-4838(95)00131-d
发表时间：
1995
期刊：
Biochimica et biophysica acta
影响因子：
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通讯作者：
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发表时间：
1994
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
Miller-Martini,DM;Hua,S;Horowitz,PM
通讯作者：
Horowitz,PM