Epitope-tagged protein-based artificial miRNA screens for optimized gene silencing in plants.
Epitope-tagged protein-based artificial miRNA screens for optimized gene silencing in plants.
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基于表位标记的蛋白质的人造miRNA筛选，用于优化植物中的基因沉默。
DOI：
10.1038/nprot.2014.061
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发表时间：
2014-04
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
人工microRNA(AmiRNA)技术在不同的植物物种中提供了高度特异和通用的基因沉默。在amiRNA应用中的主要挑战是从数百个生物信息设计的候选序列中选择有效的amiRNAs，以便在蛋白质水平上实现最大限度的靶基因沉默。为了解决这一问题，我们开发了基于表位标记的amiRNA(ETPamir)筛选，在该筛选中，编码表位标记的蛋白质的单个或多个目标基因与植物原生质体中的单个amiRNA候选基因结构性或诱导性地共表达。通过商业标签抗体的免疫印迹检测到的标记蛋白的积累，反向地和定量地反映了amiRNA在体内的有效性。从原生质体分离到最适amRNA的鉴定，核心步骤可以在2-3天内完成。ETPamir筛选避开了普遍缺乏的植物抗体和在目标mRNA或/和蛋白质水平上沉默植物amiRNA的复杂性。该方法可以推广到验证预测的植物天然miRNAs的内源靶基因。
Artificial microRNA (amiRNA) technology offers highly specific and versatile gene silencing in diverse plant species. The principal challenge in amiRNA application is to select potent amiRNAs from hundreds of bioinformatically designed candidates to enable maximal target gene silencing at the protein level. To address this issue we developed the epitope-tagged protein-based amiRNA (ETPamir) screens, in which single or multiple target genes encoding epitope-tagged proteins are constitutively or inducibly co-expressed with individual amiRNA candidates in plant protoplasts. Accumulation of tagged proteins, detected by immunoblotting with a commercial tag antibody, inversely and quantitatively reflects amiRNA efficacy in vivo. The core procedure, from protoplast isolation to identification of optimal amiRNA, can be completed in 2-3 days. The ETPamir screens circumvent the widespread shortage of plant antibodies and the complexity of plant amiRNA silencing at target mRNA or/and protein levels. This method can be extended to verify predicted endogenous target genes for plant natural miRNAs.
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通讯作者：
Hilson, Pierre
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2013-10-03
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G3 (Bethesda, Md.)
影响因子：
--
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Christian M;Qi Y;Zhang Y;Voytas DF
通讯作者：
Voytas DF