Standardizing cassette‐based deep mutagenesis by Golden Gate assembly
Standardizing cassette‐based deep mutagenesis by Golden Gate assembly
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通过 Golden Gate 组装标准化基于盒的深度诱变
DOI：
10.1002/bit.28564
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发表时间：
2023
影响因子：
3.8
通讯作者：
Whitehead, Timothy A.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Daffern, Nicolas;Francino‐Urdaniz, Irene M.;Baumer, Zachary T.;Whitehead, Timothy A.
通过合成DNA盒的Golden Gate组装构建大型深度诱变蛋白质编码文库的方案采用不同的系统特异性方法。在这里，我们提出了一个标准化的Golden Gate方法来构建用户自定义库。我们证明，25 μL反应，使用40 fmol的输入DNA，可以产生1 × 106个成员的数量级的文库，并且反应体积或输入DNA浓度可以按比例增加而不会损失转化效率。此类文库可以从简并寡核苷酸或寡核苷酸池产生的dsDNA盒构建。我们证明了它的真实的世界的有效性，通过建立定制的，用户定义的图书馆的订单104- 107独特的蛋白质编码变异的两个正交的蛋白质工程系统。我们包括一个详细的协议，并提供几个通用的目的地向量。
Protocols for the construction of large, deeply mutagenized protein encoding libraries via Golden Gate assembly of synthetic DNA cassettes employ disparate, system‐specific methodology. Here we present a standardized Golden Gate method for building user‐defined libraries. We demonstrate that a 25 μL reaction, using 40 fmol of input DNA, can generate a library on the order of 1 × 106members and that reaction volume or input DNA concentration can be scaled up with no losses in transformation efficiency. Such libraries can be constructed from dsDNA cassettes generated either by degenerate oligonucleotides or oligo pools. We demonstrate its real‐world effectiveness by building custom, user‐defined libraries on the order of 104–107unique protein encoding variants for two orthogonal protein engineering systems. We include a detailed protocol and provide several general‐use destination vectors.
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