Orthogonality of Pyrrolysine tRNA in the Xenopus oocyte.
Orthogonality of Pyrrolysine tRNA in the Xenopus oocyte.
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DOI：
10.1038/s41598-018-23201-z
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发表时间：
2018-03-26
影响因子：
4.6
通讯作者：
Ahern CA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Infield DT;Lueck JD;Galpin JD;Galles GD;Ahern CA
正交tRNA的化学氨基酰化允许广泛的合成氨基酸的遗传编码，而不需要进化特定的氨基酰tRNA合成酶。该方法与非洲爪蟾卵母细胞表达系统中的蛋白表达配对，可以从蛋白结构中提取原子尺度的功能数据，从而推进膜蛋白的研究。该方法的实用性取决于用于传递氨基酸的tRNA物种的正交性。在这里，我们报道了来自Methanosarcina barkeri fusaro的pyrrolysyl tRNA （pylT）是正交的，并且在非洲爪蟾卵母细胞的遗传密码扩增实验中具有很高的能力。数据表明，pylT在体外可被化学酰化修饰；然后用它来挽救电压门控钠通道内的细胞质位点。此外，通过在钠通道的选择性过滤器内编码赖氨酸，证明了pylT的高保真度，其中该侧链的远端胺对钠离子的识别是必不可少的。因此，pylT是通过无义抑制在爪蟾卵母细胞中传递氨基酸的合适tRNA物种。它可能被证明是有用的，在实验背景下，其中抑制trna的再酰化已被观察到。
Chemical aminoacylation of orthogonal tRNA allows for the genetic encoding of a wide range of synthetic amino acids without the need to evolve specific aminoacyl-tRNA synthetases. This method, when paired with protein expression in the Xenopus laevis oocyte expression system, can extract atomic scale functional data from a protein structure to advance the study of membrane proteins. The utility of the method depends on the orthogonality of the tRNA species used to deliver the amino acid. Here, we report that the pyrrolysyl tRNA (pylT) from Methanosarcina barkeri fusaro is orthogonal and highly competent for genetic code expansion experiments in the Xenopus oocyte. The data show that pylT is amendable to chemical acylation in vitro; it is then used to rescue a cytoplasmic site within a voltage-gated sodium channel. Further, the high fidelity of the pylT is demonstrated via encoding of lysine within the selectivity filter of the sodium channel, where sodium ion recognition by the distal amine of this side-chain is essential. Thus, pylT is an appropriate tRNA species for delivery of amino acids via nonsense suppression in the Xenopus oocyte. It may prove useful in experimental contexts wherein reacylation of suppressor tRNAs have been observed.
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