A Split NanoLuc Reporter Quantitatively Measures Circular RNA IRES Translation.
A Split NanoLuc Reporter Quantitatively Measures Circular RNA IRES Translation.
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DOI：
10.3390/genes13020357
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发表时间：
2022-02-16
期刊：
影响因子：
3.5
通讯作者：
Fuchs G
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Sehta P;Wilhelm AM;Lin SJ;Urman MA;MacNeil HA;Fuchs G
内部核糖体进入位点（IRES）是RNA二级结构，其介导独立于m7G RNA帽的翻译。双顺反子荧光素酶测定是测量IRES介导的翻译的最常用的方法。虽然这种测定是定量的，但它需要大量的控制，并且可能是耗时的。通过夹板连接产生的环状RNA已显示也准确地报告IRES介导的翻译，然而遭受低产量和其他挑战。最近，细胞序列被证明可以通过反向剪接促进RNA环的形成。在这里，我们使用先前发表的反向剪接环状RNA分裂GFP报告基因来创建高度灵敏和定量的分裂纳米荧光素酶（NanoLuc）报告基因。我们表明，NanoLuc表达需要一个真正的IRES的反向剪接和正确的方向。响应于细胞应激，IRES指导的NanoLuc表达保持稳定或增加，而加帽的对照报告基因翻译减少。此外，我们检测到NanoLuc在假定的细胞IRES和Zika病毒5′非翻译区中的表达，该区域被认为具有IRES功能。这些数据一起表明，我们的IRES报告构建体可用于验证，鉴定和定量序列介导环状RNA内IRES翻译的能力。
Internal ribosomal entry sites (IRESs) are RNA secondary structures that mediate translation independent from the m7G RNA cap. The dicistronic luciferase assay is the most frequently used method to measure IRES-mediated translation. While this assay is quantitative, it requires numerous controls and can be time-consuming. Circular RNAs generated by splinted ligation have been shown to also accurately report on IRES-mediated translation, however suffer from low yield and other challenges. More recently, cellular sequences were shown to facilitate RNA circle formation through backsplicing. Here, we used a previously published backsplicing circular RNA split GFP reporter to create a highly sensitive and quantitative split nanoluciferase (NanoLuc) reporter. We show that NanoLuc expression requires backsplicing and correct orientation of a bona fide IRES. In response to cell stress, IRES-directed NanoLuc expression remained stable or increased while a capped control reporter decreased in translation. In addition, we detected NanoLuc expression from putative cellular IRESs and the Zika virus 5′ untranslated region that is proposed to harbor IRES function. These data together show that our IRES reporter construct can be used to verify, identify and quantify the ability of sequences to mediate IRES-translation within a circular RNA.
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影响因子：
5.3
作者：
Henis-Korenblit, S;Strumpf, NL;Kimchi, A
通讯作者：
Kimchi, A
影响因子：
16
作者：
Harding, HP;Novoa, I;Ron, D
通讯作者：
Ron, D
影响因子：
5.3
作者：
Kuyumcu-Martinez, NM;Van Eden, ME;Lloyd, RE
通讯作者：
Lloyd, RE
DOI：
10.1261/rna.047126.114
发表时间：
2014-12
期刊：
RNA (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Lasda E;Parker R
通讯作者：
Parker R
影响因子：
4.5
作者：
Johannes, G;Sarnow, P
通讯作者：
Sarnow, P