A Model of Reversible Inhibitors in the Gastric H+/K+-ATPase Binding Site Determined by Rotational Echo Double Resonance NMR*
A Model of Reversible Inhibitors in the Gastric H+/K+-ATPase Binding Site Determined by Rotational Echo Double Resonance NMR*
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通过旋转回波双共振 NMR 测定胃 H /K -ATP 酶结合位点的可逆抑制剂模型*
DOI：
--
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发表时间：
2001
影响因子：
4.8
通讯作者：
D. Middleton
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Jude A. Watts;A. Watts;D. Middleton
非共价 H+/K+-ATP 酶抑制剂 SCH28080（2-甲基-3-氰基甲基-8-（苯基甲氧基）咪唑并[1,2-a]吡啶）的几种密切类似物已被筛选其活性，并通过固态 NMR 光谱检查其药理学作用位点。 TMPIP（SCH28080 的 1,2,3-三甲基类似物）以及苯甲氧基环中含有氟的 TMPIP 变体对猪 H+/K+-ATP 酶抑制的 IC50 值落在 10 μm 以下范围内。滴定到 H+/K+-ATPase 膜上的 2H 标记抑制剂的氘核磁共振谱显示，80-100% 的抑制剂与蛋白质结合，K+-竞争 2H NMR 实验证实该抑制剂位于活性位点内。 TMPIP的五氟苯基甲氧基类似物的活性结合构象是使用交叉偏振魔角旋转NMR方法REDOR通过13C-19F偶极耦合测量来确定的。研究发现，该抑制剂采用了一种能量上有利的延伸构象，介于完全平面和部分弯曲的极端之间。这些发现使得基于独立定点诱变研究的结果提出了该抑制剂与 H+/K+-ATP 酶结合的模型。在该模型中，部分弯曲的抑制剂与靠近 N 端跨膜螺旋 M1 的 Phe126 以及胞外环桥接膜螺旋 M5 和 M6 中的残基以及两侧是 M4 中的残基相互作用。
Several close analogues of the noncovalent H+/K+-ATPase inhibitor SCH28080 (2-methyl-3-cyanomethyl-8-(phenylmethoxy)imidazo[1,2-a]pyridine) have been screened for activity and examined in the pharmacological site of action by solid-state NMR spectroscopy. TMPIP, the 1,2,3-trimethyl analogue of SCH28080, and variants of TMPIP containing fluorine in the phenylmethoxy ring exhibited IC50 values for porcine H+/K+-ATPase inhibition falling in the sub-10 μm range. Deuterium NMR spectra of a2H-labeled inhibitor titrated into H+/K+-ATPase membranes revealed that 80–100% of inhibitor was bound to the protein, and K+-competition2H NMR experiments confirmed that the inhibitor lay within the active site. The active binding conformation of the pentafluorophenylmethoxy analogue of TMPIP was determined from13C–19F dipolar coupling measurements using the cross-polarization magic angle spinning NMR method, REDOR. It was found that the inhibitor adopts an energetically favorable extended conformation falling between fully planar and partially bowed extremes. These findings allowed a model to be proposed for the binding of this inhibitor to H+/K+-ATPase based on the results of independent site-directed mutagenesis studies. In the model, the partially bowed inhibitor interacts with Phe126 close to the N-terminal membrane spanning helix M1 and residues in the extracellular loop bridging membrane helices M5 and M6 and is flanked by residues in M4.
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Sachs,G