Detection of protein tyrosine kinase activity using a high-capacity streptavidin-coated membrane and optimized biotinylated peptide substrates.
Detection of protein tyrosine kinase activity using a high-capacity streptavidin-coated membrane and optimized biotinylated peptide substrates.
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使用高容量链霉亲和素包被的膜和优化的生物素化肽底物检测蛋白酪氨酸激酶活性。
作者：
E. Schaefer;S. Guimond
描述了一种蛋白酪氨酸激酶（PTK）测定系统，其使用一系列优化的生物素化肽底物与链霉亲和素包被的基质（SAM（2））生物素捕获膜。SAM（2）生物素捕获膜提供低背景和高线性结合能力（高达约3.6 nmol生物素化PTK肽/cm（2）），从而获得高信噪比和更高的重现性。磷酸化肽底物在SAM（2）膜上的捕获是快速的，并且不依赖于肽的氨基酸序列，从而克服了其他方法通常遇到的困难。两种广泛特异性的生物素化PTK肽底物被鉴定为具有最佳动力学特性，允许分析来自8种不同类型酶的成员，包括跨膜（表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子受体、胰岛素受体和血小板衍生生长因子受体）和细胞质（p43（abl）、p56（lck）、p60（src）和p93（fes））PTK。第三个生物素化的肽底物，显示出对EGFR的高度选择性，用于说明该系统的多功能性，广泛的特异性和高选择性检测PTK活性。在最佳条件下和粗细胞提取物样品中准确检测活性的能力，包括动力学分析和酶检测限在低飞摩尔范围内，支持该测定系统用于研究PTK酶的实用性。
A protein tyrosine kinase (PTK) assay system is described that uses a series of optimized biotinylated peptide substrates in conjunction with a streptavidin-coated matrix (SAM(2)) biotin capture membrane. The SAM(2) biotin capture membrane provides low backgrounds and high linear binding capacity (up to approximately 3.6 nmol of biotinylated PTK peptide/cm(2)), resulting in high signal-to-noise ratios and greater reproducibility. Capture of the phosphorylated peptide substrates onto the SAM(2) membrane is rapid and occurs independent of the amino acid sequence of the peptide, thereby overcoming difficulties commonly encountered with other methodologies. Two broad-specificity biotinylated PTK peptide substrates were identified with optimum kinetic properties, allowing members from eight distinct classes of enzymes, including transmembrane (epidermal growth factor receptor (EGFR), fibroblast growth factor receptor, insulin receptor, and platelet-derived growth factor receptor) and cytoplasmic (p43(abl), p56(lck), p60(src), and p93(fes)) PTKs, to be analyzed. A third biotinylated peptide substrate, shown to be highly selective for the EGFR, was used to illustrate the versatility of this system for both broad specificity and highly selective detection of PTK activity. The ability to accurately detect activity under optimum conditions and with crude cell extract samples, including kinetic analysis and with enzyme detection limits in the low femtomole range, supports the utility of this assay system for studying PTK enzymes.
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1992
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