Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors.
Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors.
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DOI：
10.1038/nprot.2011.387
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发表时间：
2011-10-27
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14.8
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作者：
翻译后脂质修饰的法尼化和香叶基香叶化在蛋白质定位和功能中的重要性，以及前烯基化蛋白在恶性转化中的关键作用，引起了人们对其生物学的兴趣，并开发了法尼基转移酶和香叶基香叶基转移酶抑制剂(FTI和GGTIs)作为化学探针和抗癌药物。在FTI和GGTI治疗前后测量蛋白质预烯基化的能力对于理解和解释这些药物对信号转导途径和细胞表型的影响以及将预烯基化作为生物标志物的使用是重要的。在这里，我们描述了在体外、在培养细胞以及在动物和人类的肿瘤中测量法尼基转移酶或香叶基香叶基转移酶对蛋白质预烯基化程度的方法。采用[~H]法尼基二磷酸和[~3H]香叶基二磷酸，凝胶迁移率改变，用亚细胞分级或完整细胞的免疫荧光进行膜结合，[~H]甲戊酸标记，然后进行免疫沉淀和SDS-PAGE，以及网织红细胞裂解产物的体外转录、翻译和预烯基化。这些程序需要1天(酶分析)到3个月([~3H]标记蛋白质的放射自显影)。
The importance of the post-translational lipid modifications farnesylation and geranylgeranylation in protein localization and function coupled with the critical role of prenylated proteins in malignant transformation has prompted interest in their biology and the development of farnesyl transferase and geranylgeranyl transferase inhibitors (FTIs and GGTIs) as chemical probes and anticancer agents. The ability to measure protein prenylation before and after FTI and GGTI treatment is important to understanding and interpreting the effects of these agents on signal transduction pathways and cellular phenotypes, as well as to the use of prenylation as a biomarker. Here we describe protocols to measure the degree of protein prenylation by farnesyl transferase or geranylgeranyl transferase in vitro, in cultured cells and in tumors from animals and humans. The assays use [3H]farnesyl diphosphate and [3H]geranylgeranyl diphosphate, electrophoretic mobility shift, membrane association using subcellular fractionation or immunofluorescence of intact cells, [3H]mevalonic acid labeling, followed by immunoprecipitation and SDS-PAGE, and in vitro transcription, translation and prenylation in reticulocyte lysates. These protocols require from 1 day (enzyme assays) to up to 3 months (autoradiography of [3H]-labeled proteins).
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