Selectivity over coverage in de novo sequencing of IgGs.
Selectivity over coverage in de novo sequencing of IgGs.
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DOI：
10.1039/d0sc03438j
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发表时间：
2020-11-21
期刊：
影响因子：
8.4
通讯作者：
Heck AJR
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
den Boer MA;Greisch JF;Tamara S;Bondt A;Heck AJR
产生抗体的CDR3可变区的蛋白质序列梯形图有助于通过质谱学进行从头测序。尽管特异性差异令人难以置信，但人类抗体库中数百万个独特的免疫球蛋白G(Ig G)分子拥有大部分氨基酸序列。在对抗体重新排序的尝试中，这些恒定的免疫球蛋白部分不会产生任何有用的信息。因此，只关注可变区并提供明确的序列读出的方法是非常有利的。我们报告了一种基于质谱学的方法，它使用电子捕获解离(ECD)为轻链和重链的可变部分提供简单易读的序列梯形图，并优先选择功能重要的CDR3。我们在治疗性抗体曲妥珠单抗上对这种方法进行了优化，并证明了它在四个免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的两个单抗四重组上的适用性。该方法基于蛋白质水解法将可变的F(ab‘)2部分从保守的Fc部分分离出来，然后用ECD对F(ab’)2部分进行质量分析和碎裂。纯ECD，没有额外的碰撞激活，导致覆盖轻链和重链的CDR3的简单易读的序列标签。利用分子模拟和结构分析，我们讨论和解释了这种选择性的碎裂行为，并描述了不同免疫球蛋白亚类的结构特征如何导致不同的碎裂模式。总体而言，我们预计F(ab‘)2或Fab分子上的纯ECD可以成为血清抗体从头测序的有价值的工具。
Generating protein sequence ladders of the CDR3 variable regions of antibodies facilitates de novo sequencing by mass spectrometry. Although incredibly diverse in specificity, millions of unique Immunoglobulin G (IgG) molecules in the human antibody repertoire share most of their amino acid sequence. These constant parts of IgG do not yield any useful information in attempts to sequence antibodies de novo. Therefore, methods focusing solely on the variable regions and providing unambiguous sequence reads are strongly advantageous. We report a mass spectrometry-based method that uses electron capture dissociation (ECD) to provide straightforward-to-read sequence ladders for the variable parts of both the light and heavy chains, with a preference for the functionally important CDR3. We optimized this method on the therapeutic antibody Trastuzumab and demonstrate its applicability on two monoclonal quartets of the four IgG subclasses, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. The method is based on proteolytically separating the variable F(ab′)2 part from the conserved Fc part, whereafter the F(ab′)2 portions are mass-analyzed and fragmented by ECD. Pure ECD, without additional collisional activation, leads to straightforward-to-read sequence tags covering the CDR3 of both the light and heavy chains. Using molecular modelling and structural analysis, we discuss and explain this selective fragmentation behavior and describe how structural features of the different IgG subclasses lead to distinct fragmentation patterns. Overall, we foresee that pure ECD on F(ab′)2 or Fab molecules can become a valuable tool for the de novo sequencing of serum antibodies.
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人类本地抗体的从头开始的MS/MS测序。
影响因子：
4.4
作者：
Guthals A;Gan Y;Murray L;Chen Y;Stinson J;Nakamura G;Lill JR;Sandoval W;Bandeira N
通讯作者：
Bandeira N
影响因子：
5.8
作者：
Klein, Joshua;Carvalho, Luis;Zaia, Joseph
通讯作者：
Zaia, Joseph
影响因子：
4.8
作者：
Hui, Gar Kay;Gardener, Antoni D.;Perkins, Stephen J.
通讯作者：
Perkins, Stephen J.
DOI：
10.1074/mcp.m114.039537
发表时间：
2014-11
期刊：
Molecular & cellular proteomics : MCP
影响因子：
--
作者：
Bondt A;Rombouts Y;Selman MH;Hensbergen PJ;Reiding KR;Hazes JM;Dolhain RJ;Wuhrer M
通讯作者：
Wuhrer M
影响因子：
5.7
作者：
Marklund, Erik G.;Degiacomi, Matteo T.;Benesch, Justin L. P.
通讯作者：
Benesch, Justin L. P.