Expression and Purification of tRNA/ pre-miRNA-Based Recombinant Noncoding RNAs.
Expression and Purification of tRNA/ pre-miRNA-Based Recombinant Noncoding RNAs.
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DOI：
10.1007/978-1-0716-1499-0_18
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发表时间：
2021
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RNA 功能和治疗潜力的研究以化学工程 RNA 模拟物的使用为主。最近的努力已经导致建立了用于生产重组或生物工程RNA分子的新技术，这些技术应该更好地概括天然RNA的结构、功能和安全性，因为两者都是在活细胞中产生和折叠的。在此，我们描述了一种基于最佳混合 tRNA/pre-miRNA 载体的可重复发酵生产携带弹头 miRNA、siRNA、适体或其他形式小 RNA 的生物工程 RNA 试剂 (BERA) 的稳健方法。目标 BERA/sRNA 可通过快速蛋白液相色谱 (FPLC) 轻松纯化，并达到高度同质性 (>97%)。这种方法提供了一致的高水平表达（> 细菌总 RNA 的 30%）和大规模生产即用型 BERA（1 L 细菌培养物中的数毫克至数十毫克）。
Research on RNA function and therapeutic potential is dominated by the use of chemoengineered RNA mimics. Recent efforts have led to the establishment of novel technologies for the production of recombinant or bioengineered RNA molecules, which should better recapitulate the structures, functions and safety profiles of natural RNAs because both are produced and folded in living cells. Herein, we describe a robust approach for reproducible fermentation production of bioengineered RNA agents (BERAs) carrying warhead miRNAs, siRNAs, aptamers, or other forms of small RNAs, based upon an optimal hybrid tRNA/pre-miRNA carrier. Target BERA/sRNAs are readily purified by fast protein liquid chromatography (FPLC) to a high degree of homogeneity (>97%). This approach offers a consistent high-level expression (>30% of total bacterial RNAs) and large-scale production of ready-to-use BERAs (multiple to tens milligrams from 1 L bacterial culture).