A recombineering pipeline to clone large and complex genes in Chlamydomonas
A recombineering pipeline to clone large and complex genes in Chlamydomonas
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克隆衣藻中大型复杂基因的重组工程管道
DOI：
10.1101/2020.05.06.080416
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发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Emrich-Mills T
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Emrich-Mills T
克隆基因的能力极大地推进了细胞和分子生物学研究，使研究人员能够产生荧光蛋白融合物用于定位，并通过突变互补来确认遗传原因。大多数基因克隆都依赖于聚合酶链式反应（PCR）或DNA合成，随着基因大小的增加，特别是如果它们包含复杂的区域，这可能会变得昂贵和技术上具有挑战性。这一直是一个长期存在的挑战衣原体reinhardtii研究社区，因为这种衣原体有很高的比例的基因含有复杂的序列结构。在这里，我们克服了这些挑战，通过开发一个重组工程管道，从衣原体细菌人工染色体收集基因的快速平行克隆。为了产生用于定位的荧光蛋白融合体，我们将批量和高通量规模的流水线应用于与衣原体CO2浓缩机制（CCM）相关的203个基因，总体克隆成功率为77%。克隆的成功与基因的大小和复杂性无关，克隆的基因最大可达23 kb。CCM目标的一个子集的定位证实了以前的质谱数据，确定了新的蛋白核成分，并使突变体的互补。我们提供了载体和详细的协议，以促进这项技术的简单采用，我们设想这将为藻类和植物研究开辟新的可能性。
The ability to clone genes has greatly advanced cell and molecular biology research, enabling researchers to generate fluorescent protein fusions for localization and confirm genetic causation by mutant complementation. Most gene cloning is polymerase chain reaction (PCR) or DNA synthesis-dependent, which can become costly and technically challenging as genes increase in size, particularly if they contain complex regions. This has been a long-standing challenge for theChlamydomonas reinhardtiiresearch community, as this alga has a high percentage of genes containing complex sequence structures. Here we overcame these challenges by developing a recombineering pipeline for the rapid parallel cloning of genes from a Chlamydomonas bacterial artificial chromosome collection. To generate fluorescent protein fusions for localization, we applied the pipeline at both batch and high-throughput scales to 203 genes related to the Chlamydomonas CO2concentrating mechanism (CCM), with an overall cloning success rate of 77%. Cloning success was independent of gene size and complexity, with cloned genes as large as 23 kb. Localization of a subset of CCM targets confirmed previous mass spectrometry data, identified new pyrenoid components, and enabled complementation of mutants. We provide vectors and detailed protocols to facilitate easy adoption of this technology, which we envision will open up new possibilities in algal and plant research.
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影响因子：
16.6
作者：
Bansal V;Mitjans M;Burik CAP;Linnér RK;Okbay A;Rietveld CA;Begemann M;Bonn S;Ripke S;de Vlaming R;Nivard MG;Ehrenreich H;Koellinger PD
通讯作者：
Koellinger PD
影响因子：
3.7
作者：
Yu Zhan;C. Marchand;Alexandre Maes;Adeline Mauriès;Yi Sun;James S. Dhaliwal;J. Uniacke;Simon Arragain;Heng Jiang;Nicholas D. Gold;V. Martin;S. Lemaire;W. Zerges
通讯作者：
W. Zerges
DOI：
10.1073/pnas.0811268106
发表时间：
2009-02-03
影响因子：
11.1
作者：
Uniacke, James;Zerges, William
通讯作者：
Zerges, William
DOI：
10.1073/pnas.1522866113
发表时间：
2016-05-24
影响因子：
11.1
作者：
Mackinder, Luke C. M.;Meyer, Moritz T.;Jonikas, Martin C.
通讯作者：
Jonikas, Martin C.
DOI：
10.1111/tpj.13033
发表时间：
2015-11
期刊：
The Plant journal : for cell and molecular biology
影响因子：
--
作者：
Barahimipour R;Strenkert D;Neupert J;Schroda M;Merchant SS;Bock R
通讯作者：
Bock R