Comprehensive analysis and accurate quantification of unintended large gene modifications induced by CRISPR-Cas9 gene editing.
Comprehensive analysis and accurate quantification of unintended large gene modifications induced by CRISPR-Cas9 gene editing.
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对 CRISPR-Cas9 基因编辑引起的非预期大基因修饰进行全面分析和准确定量。
DOI：
10.1126/sciadv.abo7676
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发表时间：
2022-10-21
期刊：
影响因子：
13.6
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
迄今为止，大多数基因组编辑分析都是基于量化小的插入和删除。在这里，我们证明 CRISPR-Cas9 基因组编辑可以在不同的原代细胞和细胞系中诱导大的基因修饰，例如删除、插入和复杂的局部重排。我们使用不同的方法分析了造血干细胞和祖细胞（HSPC）中的大缺失事件，包括克隆基因分型、液滴数字聚合酶链式反应、具有独特分子标识符的单分子实时测序以及长扩增子测序测定。我们的结果表明，在 HSPC 中的 HBB（11.7% 至 35.4%）、HBG（14.3%）和 BCL11A（13.2%）基因以及 T 细胞中的 PD-1（15.2%）基因上的 Cas9 靶向切割位点上，高达数千个碱基的大缺失发生频率很高。我们的发现对于推进治疗人类疾病的基因组编辑技术具有重要意义，因为意外的大基因修饰可能持续存在，从而改变生物功能并减少可用的治疗等位基因。基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑可能会产生高水平的非预期基因修饰，包括大量删除和插入。
Most genome editing analyses to date are based on quantifying small insertions and deletions. Here, we show that CRISPR-Cas9 genome editing can induce large gene modifications, such as deletions, insertions, and complex local rearrangements in different primary cells and cell lines. We analyzed large deletion events in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) using different methods, including clonal genotyping, droplet digital polymerase chain reaction, single-molecule real-time sequencing with unique molecular identifier, and long-amplicon sequencing assay. Our results show that large deletions of up to several thousand bases occur with high frequencies at the Cas9 on-target cut sites on the HBB (11.7 to 35.4%), HBG (14.3%), and BCL11A (13.2%) genes in HSPCs and the PD-1 (15.2%) gene in T cells. Our findings have important implications to advancing genome editing technologies for treating human diseases, because unintended large gene modifications may persist, thus altering the biological functions and reducing the available therapeutic alleles. CRISPR-Cas9–based genome editing can have a high level of unintended gene modifications including large deletions and insertions.
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