An E2-ubiquitin thioester-driven approach to identify substrates modified with ubiquitin and ubiquitin-like molecules.
An E2-ubiquitin thioester-driven approach to identify substrates modified with ubiquitin and ubiquitin-like molecules.
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DOI：
10.1038/s41467-018-07251-5
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发表时间：
2018-11-14
影响因子：
16.6
通讯作者：
Mansfeld J
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bakos G;Yu L;Gak IA;Roumeliotis TI;Liakopoulos D;Choudhary JS;Mansfeld J
蛋白质与泛素和泛素样分子的共价修饰对许多生物过程都是有帮助的。然而，确定负责这些修饰的E3连接酶仍然是泛素研究的主要瓶颈。本文提出了一种E2-硫酯驱动鉴定（E2~dID）方法，用于鉴定特定E2和E3酶对的底物。E2~dID利用E2偶联酶在泛素化级联中的中心位置，并提供体外生成的生物素化E2~泛素硫酯偶联物作为提取物中泛素化的唯一来源。这使得在严格的条件下纯化和基于质谱的修饰蛋白鉴定独立于提取物的生物来源。我们通过鉴定和验证人类细胞中APC/C底物来证明E2-dID的敏感性和特异性。最后，我们在S. cerevisiae中使用SUMO进行了E2~dID，表明该方法可以很容易地适用于其他泛素样修饰剂和实验模型。泛素化和泛素样修饰蛋白调节多种细胞过程，但确定特定E2和E3酶的底物仍然具有挑战性。在这里，作者将E2酶与富集的泛素衍生物结合，通过质谱法鉴定特定E2/E3对的底物。
Covalent modifications of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules are instrumental to many biological processes. However, identifying the E3 ligase responsible for these modifications remains a major bottleneck in ubiquitin research. Here, we present an E2-thioester-driven identification (E2~dID) method for the targeted identification of substrates of specific E2 and E3 enzyme pairs. E2~dID exploits the central position of E2-conjugating enzymes in the ubiquitination cascade and provides in vitro generated biotinylated E2~ubiquitin thioester conjugates as the sole source for ubiquitination in extracts. This enables purification and mass spectrometry-based identification of modified proteins under stringent conditions independently of the biological source of the extract. We demonstrate the sensitivity and specificity of E2-dID by identifying and validating substrates of APC/C in human cells. Finally, we perform E2~dID with SUMO in S. cerevisiae, showing that this approach can be easily adapted to other ubiquitin-like modifiers and experimental models. Ubiquitination and ubiquitin-like modifications of proteins regulate multiple cellular processes but identifying substrates of specific E2 and E3 enzymes remains challenging. Here, the authors conjugate E2 enzymes with enrichable ubiquitin derivatives to identify substrates of specific E2/E3 pairs by mass spectrometry.
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影响因子：
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作者：
Eguren, Manuel;Alvarez-Fernandez, Monica;Malumbres, Marcos
通讯作者：
Malumbres, Marcos
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通讯作者：
Li S
DOI：
10.1074/mcp.m116.062125
发表时间：
2017-05
期刊：
Molecular & cellular proteomics : MCP
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--
作者：
Cai L;Tu J;Song L;Gao Z;Li K;Wang Y;Liu Y;Zhong F;Ge R;Qin J;Ding C;He F
通讯作者：
He F
DOI：
10.1073/pnas.1216880109
发表时间：
2012-12-04
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通讯作者：
Cleveland, Don W.
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10.1016/j.bbrc.2005.08.132
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Giannakopoulos, NV;Luo, JK;Zhang, DE
通讯作者：
Zhang, DE