A robust strategy for negative selection of Cre-loxP recombination-based excision of transgenes in induced pluripotent stem cells.
A robust strategy for negative selection of Cre-loxP recombination-based excision of transgenes in induced pluripotent stem cells.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0064342
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发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Leong KW
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chakraborty S;Christoforou N;Fattahi A;Herzog RW;Leong KW
病毒载体在诱导多能干细胞（iPSC）的衍生中仍然是最有效和最受欢迎的。对于翻译，重要的是在诱导多能性后沉默或去除重编程因子。在这项研究中，我们设计了一种可切除的loxP侧翼慢病毒构建体，a）在由强EF-1α启动子表达的单个慢病毒载体中包括所有重编程元件; B）能够容易地测定慢病毒滴度; c）能够使用LoxP位点特异性Cre重组酶切除和单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦去除转基因和富集细胞（HSV-tk/gan）阴性选择;和d）允许以集落形式进行转基因切除。可以一致地获得与文献中报道的没有加强分子的重编程效率相当的重编程效率。为了进一步证明这种Cre-loxP/HSV-tk/gan策略的实用性，我们在iPSC中掺入了非病毒治疗性转基因（人凝血因子IX），其表达可以通过Cre重组酶的时间脉冲来控制。该平台的稳健性使得能够实施有效且具有成本效益的iPSC生成方案及其后续转基因用于下游研究。
Viral vectors remain the most efficient and popular in deriving induced pluripotent stem cells (iPSCs). For translation, it is important to silence or remove the reprogramming factors after induction of pluripotency. In this study, we design an excisable loxP-flanked lentiviral construct that a) includes all the reprogramming elements in a single lentiviral vector expressed by a strong EF-1α promoter; b) enables easy determination of lentiviral titer; c) enables transgene removal and cell enrichment using LoxP-site-specific Cre-recombinase excision and Herpes Simplex Virus-thymidine kinase/ganciclovir (HSV-tk/gan) negative selection; and d) allows for transgene excision in a colony format. A reprogramming efficiency comparable to that reported in the literature without boosting molecules can be consistently obtained. To further demonstrate the utility of this Cre-loxP/HSV-tk/gan strategy, we incorporate a non-viral therapeutic transgene (human blood coagulation Factor IX) in the iPSCs, whose expression can be controlled by a temporal pulse of Cre recombinase. The robustness of this platform enables the implementation of an efficacious and cost-effective protocol for iPSC generation and their subsequent transgenesis for downstream studies.
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