白藜芦醇通过TET1抑制Wnt/β-catenin通路在宫颈癌中的治疗作用研究-猫眼课题宝

DOI：

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发表时间：

2022

期刊：

硕士研究生毕业论文

影响因子：

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通讯作者：

中科院分区：

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文献类型：

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作者：

任吉;朱小雨;陈秀英;闵少菊;徐殿琴;谭玉洁

探究白藜芦醇（Resveratrol, RES）对于....(Ten-Eleven Translocation 1, TET1）及Wnt/β-catenin的通路影响，以及该过程中所涉及的分子机制，阐明RES对宫颈癌治疗的潜在价值。方法：观察分析经不同浓度RES处理后，宫颈癌细胞SiHa和HeLa的TET1表达、Wnt/β-catenin信号通路以及细胞生物学行为的变化情况。进而通过在宫颈癌细胞中敲低TET1，观察TET1在白藜芦醇治疗中的的关键介导作用。1. 将宫颈癌细胞SiHa与HeLa分成二甲基亚砜溶剂对照组(DMSO组) 及RES处理组，通过CCK-8试验检测不同浓度(60μM、120μM、240μM、320μM、350μM) RES在不同时间点(24h, 48h)对细胞生长的抑制作用。2. 通过划痕实验、Trans well实验和单克隆形成实验分别检测RES处理对宫颈癌细胞迁移、侵袭以及克隆形成能力的影响。3. 利用Western blot和细胞免疫荧光分别检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin、Snail与Vimentin表达变化。4. 通过Western blot和凋亡检测试剂盒检测RES处理SiHa与HeLa细胞后细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl2表达变化。5. 采用Western blot与细胞免疫荧光方法分别检测RES处理后SiHa与HeLa细胞E6与p53表达情况。6. 利用RT-qPCR检测RES处理SiHa与HeLa细胞后TET1 mRNA表达情况；并通过细胞免疫荧光检测RES对SiHa与HeLa细胞5-甲基胞嘧啶（5mc）、5-羟甲基胞嘧啶（5hmc）表达的影响。7. Western blot检测RES处理SiHa与HeLa细胞后TET1、β-catenin、GSK-3β、Wnt-3α和c-myc的蛋白表达变化。8. 在SiHa与HeLa细胞中利用小干扰RNA敲低TET1后检测β-catenin蛋白表达变化，并在敲低TET1基础上加RES处理，Western blot检测β-catenin蛋白表达变化情况。9. SiHa与HeLa细胞在敲低TET1的基础上加RES处理后，利用划痕、Trans well实验分别检测SiHa与HeLa细胞迁移、侵袭改变。10. 将雌性裸鼠(6-8周龄)分成生理盐水组及RES处理组，每组5只，在裸鼠皮下按1x107个/只细胞数量分别于裸鼠皮下接种SiHa或HeLa细胞，7天后于裸鼠腹腔注射RES(50mg/kg)，连续注射14天，之后麻醉处死裸鼠取出肿瘤称重观察RES对宫颈癌细胞体内成瘤的影响。11. 10%多聚甲醛固定SiHa与HeLa细胞荷瘤组织后，利用免疫组化检测肿瘤中TET1、β-catenin、GSK-3β、5mc与5hmc的表达变化。结果：.1.CCK-8结果显示，RES可显著抑制宫颈癌细胞活力，并具有剂量与时间依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)；.2.细胞划痕、Trans well及克隆形成实验显示，与DMSO组相比，在经RES处理后SiHa与HeLa细胞的愈合程度、侵袭及克隆形成能力较DMSO组明显受到抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)；.3.Western blot及细胞免疫荧光结果分别显示，与DMSO组相比，RES处理SiHa和HeLa细胞后EMT标志蛋白E-cadherin蛋白表达明显升高，Snail与Vimentin的表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；4.Western blot结果显示，在SiHa和HeLa细胞中，与DMSO组相比，RES能明显抑制凋亡相关蛋白Bcl2表达，而升高Bax表达，差异具有统计学(P<0.05)，此外凋亡染色试剂盒检测结果亦表明RES可增强SiHa与HeLa细胞的凋亡程度；5.Western blot结果显示，与DMSO组相比，RES可明显抑制SiHa和HeLa细胞E6蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)；细胞免疫荧光结果显示，与DMSO组相比，RES能升高p53的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)；.6.RES处理SiHa和HeLa细胞24h后，通过RT-qPCR检测发现，与DMSO组相比，TET1 mRNA表达显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，细胞免疫荧光结果显示，与DMSO组相比，经RES处理之后SiHa与HeLa细胞5mc表达下调、5hmc表达上调；.7.Western blot结果显示，与DMSO组相比，经RES处理后SiHa和HeLa细胞，TET1与GSK-3β蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，β-catenin、Wnt-3α和c-myc的蛋白表达明显抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)；8.在敲低TET1后，SiHa与HeLa细胞中β-catenin表达明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；在此基础上加RES处理，然后与siNC+RES组比较， RES对β-catenin蛋白的抑制作用明显减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)；.9.在敲低TET1的基础上，加RES处理SiHa与HeLa细胞后，与siNC+RES组相比，细胞划痕和Trans well实验结果显示RES对SiHa与HeLa细胞迁移与侵袭的抑制作用减弱，差异具有统计学意义(P<0.05)；10.在裸鼠体内，与生理盐水组（NS组）相比，RES可明显抑制SiHa与HeLa细胞肿瘤的形成，差异具有统计学意义(P<0.05)；11.免疫组化结果显示，与生理盐水组对比，SiHa与HeLa细胞荷瘤组织内， RES处理组的TET1、5hmc和GSK-3β的表达升高，而β-catenin和5mc表达降低。结论：本研究在体内外实验中阐述了RES在抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及EMT中的作用，证实在宫颈癌细胞中RES可能通过TET1下调Wnt/β-catenin，从而抑制宫颈癌细胞迁移与侵袭，为RES在子宫颈癌治疗中的作用和靶点研究提供了实验依据。