丙戊酸对双峰驼成纤维细胞重编程影响
丙戊酸对双峰驼成纤维细胞重编程影响
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DOI：
10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.014
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发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
张勇
中科院分区：
文献类型：
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作者：
张启冉;李宗帅;马甜;李怡娜;赵兴绪;张勇
【目的】探讨提高双峰驼成纤维细胞重编程效率,减少因原癌基因引入造成致瘤风险。试验在成纤维细胞重编程过程中添加丙戊酸(valproic acid,VPA),探索小分子物质对双峰驼成纤维细胞重编程的影响,为双峰驼发病机制研究提供参考依据。【方法】采用3月龄双峰驼胎儿成纤维细胞,结合经典诱导组合OSKM(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc及治疗)和EGFP等5种逆转录病毒对双峰驼成纤维细胞进行重编程(OSKM组),并在第二次病毒感染后添加VPA处理7 d(OSKM+VPA组)收集细胞。利用PCR技术对所得细胞进行内、外源基因检测以证实逆转录病毒对双峰驼成纤维细胞的修饰作用,根据RNA-seq数据从VPA影响较为明显的基因中随机挑选8个基因,检验其在添加VPA前后的变化趋势是否与RNA-seq数据趋势一致,以验证RNA-seq数据的准确性。通过GO分析对转录组样本基因进行分类,并使用KEGG通路富集分析和超几何验证分析明确目的基因显著富集通路。对收集到的细胞进行总RNA提取并结合RNA-seq技术和实时荧光定量PCR(Real time-quantitative interpretation,RT-qPCR)技术检测VPA对双峰驼成纤维细胞重编程的影响。【结果】使用PCR技术检测内、外源基因在不同分组的表达,结果显示nSox2、Sox2、Oct4、Klf4、c-Myc在OSKM和OSKM+VPA组中均有表达,且OSKM+VPA组表达量高于OSKM组,而其在BCEFs组不表达。随机挑选8个基因检测,结果表明与细胞周期信号通路有关的TP53、CCNB1、CDC20这3个基因在添加VPA后表达量下调;与癌症表型特征相关的S100A4、CKS2、VIM、MMP9表达下调;PI3k-Akt信号通路中VEGFC表达上调;此表达趋势与组学数据趋势一致。结果显示在添加VPA后,增殖基因Mki67和PCNA表达下调,而凋亡基因CASP7表达上调。对转录组数据进行KEGG和超几何验证分析,根据分析结果筛选出959个差异表达基因,富集在276个信号通路中,其中Q值小于0.05的信号通路有八条:类固醇生物合成、细胞周期、PPAR信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟、脂肪酸代谢、ECM-受体相互作用、细胞黏附分子和胆固醇代谢。经筛选获得与细胞周期、脂肪酸代谢、细胞黏附分子和胆固醇代谢等相关的26个差异表达基因,并随机选取其中四个基因进行检测,结果表明:VPA可使双峰驼成纤维细胞黏附分子信号通路中L1CAM、CNTN1、 NFASC三个基因表达上调,细胞间互作增强,同时上调脂肪酸信号通路中CD36基因的表达。【结论】VPA可将细胞阻滞在分裂期之前,以减少重编程过程中分化几率。同时,VPA对双峰驼成纤维细胞重编程过程中多条信号通路均具有影响,调节信号通路中相关基因表达趋势,有效提高细胞重编程效率,在双峰驼成纤维细胞重编程中发挥重要作用。