CRISPR RNA-guided DNA cleavage by reconstituted Type I-A immune effector complexes.
CRISPR RNA-guided DNA cleavage by reconstituted Type I-A immune effector complexes.
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DOI：
10.1007/s00792-018-1057-0
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发表时间：
2019-01
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Terns MP
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Majumdar S;Terns MP
不同的CRISPR-Cas免疫系统保护古细菌和细菌免受病毒和其他移动的遗传元件的侵害。所有的CRISPR-Cas系统最终都通过序列特异性破坏入侵的互补核酸来发挥功能。然而，每种CRISPR系统都使用组成不同的crRNP [CRISPR（cr）RNA/Cas蛋白]免疫效应物复合物，通过独特的分子机制识别和破坏侵入性核酸。此前，我们发现来自激烈火球菌的I-A型（Csa）效应子crRNP在体内具有消除入侵DNA的功能。在这里，我们在体外用重组Csa蛋白和合成crRNA重建功能性I-A型效应crRNP，并表征crRNP组装、靶DNA识别和切割的特性。Csa 4-1、Cas 3 ″、Cas 3 ′、Cas 5a、Csa 2、Csa 5是选择性靶DNA结合和切割所必需的6种蛋白质。天然凝胶位移分析和UV诱导的RNA-蛋白质交联证明Cas 5a和Csa 2分别与crRNA 5′标签和指导序列直接相互作用。突变分析表明，Cas 3 ″是复合物的效应核酸酶。总之，我们的结果表明，I-A型crRNP的DNA切割需要crRNA引导的和前间隔区相邻基序依赖性靶DNA结合，以解旋双链DNA并暴露单链，以进行由整合的Cas 3 ′解旋酶和Cas 3 ″核酸酶crRNP组分催化的ATP依赖性3′-5′切割。
Diverse CRISPR-Cas immune systems protect archaea and bacteria from viruses and other mobile genetic elements. All CRISPR-Cas systems ultimately function by sequence-specific destruction of invading complementary nucleic acids. However, each CRISPR system uses compositionally distinct crRNP [CRISPR (cr) RNA/Cas protein] immune effector complexes to recognize and destroy invasive nucleic acids by unique molecular mechanisms. Previously, we found that Type I-A (Csa) effector crRNPs from Pyrococcus furiosus function in vivo to eliminate invader DNA. Here, we reconstituted functional Type I-A effector crRNPs in vitro with recombinant Csa proteins and synthetic crRNA and characterized properties of crRNP assembly, target DNA recognition and cleavage. Six proteins (Csa 4–1, Cas3″, Cas3′, Cas5a, Csa2, Csa5) are essential for selective target DNA binding and cleavage. Native gel shift analysis and UV-induced RNA–protein crosslinking demonstrate that Cas5a and Csa2 directly interact with crRNA 5′ tag and guide sequences, respectively. Mutational analysis revealed that Cas3″ is the effector nuclease of the complex. Together, our results indicate that DNA cleavage by Type I-A crRNPs requires crRNA-guided and protospacer adjacent motif-dependent target DNA binding to unwind double-stranded DNA and expose single strands for progressive ATP-dependent 3′–5′ cleavage catalyzed by integral Cas3′ helicase and Cas3″ nuclease crRNP components.
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影响因子：
16
作者：
Hale, Caryn R.;Majumdar, Sonali;Elmore, Joshua;Pfister, Neil;Compton, Mark;Olson, Sara;Resch, Alissa M.;Glover, Claiborne V. C., III;Graveley, Brenton R.;Terns, Rebecca M.;Terns, Michael P.
通讯作者：
Terns, Michael P.
影响因子：
5.6
作者：
Lintner NG;Frankel KA;Tsutakawa SE;Alsbury DL;Copié V;Young MJ;Tainer JA;Lawrence CM
通讯作者：
Lawrence CM
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作者：
Deveau, Helene;Barrangou, Rodolphe;Moineau, Sylvain
通讯作者：
Moineau, Sylvain
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11.4
作者：
Beloglazova, Natalia;Petit, Pierre;Yakunin, Alexander F.
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Yakunin, Alexander F.
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作者：
Elmore JR;Sheppard NF;Ramia N;Deighan T;Li H;Terns RM;Terns MP
通讯作者：
Terns MP