Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems.
Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems.
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DOI：
10.3791/62728
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发表时间：
2021-06-14
影响因子：
1.2
通讯作者：
Reuel, Nigel F.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Dopp, Jared L.;Reuel, Nigel F.
该方案描述了最小DNA模板的设计和酶促扩增的步骤，使得使用无细胞表达在不到24小时内快速原型化可测定的蛋白质。从供应商处接收DNA后，对基因片段进行PCR扩增、切割、环化和冷冻库化。然后稀释少量的库存DNA，并使用等温滚环扩增（RCA）进行显著扩增（高达106 x）。RCA可以从皮克水平的起始材料（如果使用所有起始合成片段，则为mg水平）产生微克量的最小表达模板。在这项工作中，20 μ g的起始量产生4 μg的最终产物。所得RCA产物（最小模板的多联体）可直接加入无细胞反应中，无需纯化步骤。由于这种方法完全基于PCR，当与自动化液体处理系统结合时，它可以使未来的高通量筛选工作成为可能。该研究描述了一种从合成基因片段中创建大量（μg-mg）DNA用于蛋白质筛选活动的方案，而无需克隆或使用活细胞。将最小模板酶促消化并环化，然后使用等温滚环扩增进行扩增。可以用未纯化的产物进行无细胞表达反应。
This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 μg of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems. The study describes a protocol for creating large (μg-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.
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