K^+-Cl^- cotransporter 1 (KCC1) negatively regulates NGF-induced neurite outgrowth in PC12 cells.
K^+-Cl^- cotransporter 1 (KCC1) negatively regulates NGF-induced neurite outgrowth in PC12 cells.
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K^ -Cl^- 协同转运蛋白 1 (KCC1) 负向调节 NGF 诱导的 PC12 细胞中的神经突生长。
DOI：
10.1159/000341436
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发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
H.
中科院分区：
文献类型：
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作者：
Nagao;H.
クロライドイオンを細胞外から細胞内へ輸送する Na+/K+/2Cl-共輸送体 (NKCC) がケルセチンにより活性化されると神経突起伸長が促進され, NKCC を knock down した PC12 細胞では神経突起伸長が抑制されることが知られている. クロライドイオンを細胞内から細胞外へカリウムイオンとともに輸送する K+/Cl-共輸送体 (KCC) は, その機能を阻害することで細胞内クロライドイオン濃度が上昇するが, そのことと神経突起伸長との関わりについては明らかにされていない. 申請者は, ラットの褐色細胞腫 PC12 細胞に NGF を導入したときの神経突起伸長における KCC の役割について検索した. まず, KCC 阻害剤である DIOA の作用により, 神経突起が伸長されるかについて検討した. PC12 の培養液の well に NGF を加えるのと同時に DMSO (control), DIOA (10, 20, 50,100 μM) を加えて培養処理後 5 日目の細胞をホルマリン固定し, Alexa488-Phalloidin にて染色した. 蛍光顕微鏡にて細胞の神経突起の長さと数を計測し, 統計学的に検討した. 単一の神経細胞突起の伸長について, DIOA (10, 20, 50,100 μM) を加えた群はいずれの濃度でも DMSO を加えた群に比べ有意に神経突起の伸長を認め, 特に DIOA 50μM を加えた群が他の濃度の群に比べて最も伸長が大きかった. 細胞あたりの神経細胞突起の数は各群で有意差は認めなかった. 次に, 4 つのサブタイプを持つ KCC のうち, どのサブタイプが最も神経突起の伸長に関わるのかを検討した. PC12 細胞より抽出した KCC の RNA をもとに plasmid DNA を作成し, real-time PCR 法にて KCC の絶対定量を行った. 最も多く発現したのは KCC1 で, なおかつ NGF を加えることで発現の減少がみられたのも KCC1 であった. 神経突起伸長に最も関与するサブタイプが KCC1 であることが示唆された. 最後に, RNAinterference 法により KCC1 を knockdown させた細胞で, 神経突起伸長は促進されるかについて検討した. コントロール実験用の蛍光およびラット KCC1 に対する 3 種類の siRNA を PC12 細胞に transfection して KCC1 の knockdown を行い, NGF 処理を行って培養した 5 日目の細胞から KCC1 の mRNA を採取し, plasmid DNA を用いた real-time PCR 法にてそれらの絶対定量を行った. 細胞をホルマリン固定し, Alexa488-Phalloidin にて染色して, 蛍光顕微鏡にて神経突起伸長と数について解析した. いずれの siRNA においてもその発現量は有意に低下し, 単一の神経突起の伸長はいずれの siRNA においても有意に増加した. 単一の神経細胞突起の数はいずれの siRNA においても有意差は認めなかった. これらの結果は, PC12 細胞の神経突起伸長において KCC1 が negative regulator であることを強く示唆した. 以上が本論文の要旨であるが, 神経細胞突起伸長に関わる要素として KCC1 を介した細胞内クロライドイオン濃度調節に着目し, それが神経細胞突起伸長において負の調節因子となっていることを明らかにするとともに, 例えば生体内の KCC1 の抑制により末梢神経細胞再生を促すといった臨床応用への可能性を示した点で, 医学上価値ある研究と認める.