GFP reporter screens for the engineering of amino acid degrading enzymes from libraries expressed in bacteria.
GFP reporter screens for the engineering of amino acid degrading enzymes from libraries expressed in bacteria.
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GFP 报告基因从细菌表达的文库中筛选氨基酸降解酶的工程。
DOI：
10.1007/978-1-62703-293-3_3
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发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Stone,Everett
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Paley,Olga;Agnello,Giulia;Cantor,Jason;Yoo,TaeHyun;Georgiou,George;Stone,Everett
对将人氨基酸降解酶工程化为非免疫原性化学治疗剂存在显著兴趣。我们描述了一种高通量的荧光激活细胞分选（FACS）检测细菌中的氨基酸降解酶的催化活性，在单细胞水平。该测定依赖于在适当的大肠杆菌遗传背景中将GFP报告基因的合成与所需氨基酸降解酶的催化活性偶联。这里描述的方法允许比以前可能的更大的文库（106-107）的容易筛选。我们展示了这种技术在筛选细菌和人天冬酰胺酶文库中的应用，以及工程化人甲硫氨酸γ裂解酶的催化优化。
There is significant interest in engineering human amino acid degrading enzymes as non-immunogenic chemotherapeutic agents. We describe a high-throughput fluorescence activated cell sorting (FACS) assay for detecting the catalytic activity of amino acid degrading enzymes in bacteria, at the single cell level. This assay relies on coupling the synthesis of the GFP reporter to the catalytic activity of the desired amino acid degrading enzyme in an appropriateE.coligenetic background. The method described here allows facile screening of much larger libraries (106–107) than was previously possible. We demonstrate the application of this technique in the screening of libraries of bacterial and human asparaginases and also for the catalytic optimization of an engineered human methionine gamma lyase.
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