siRNA 特异性干扰 EgRad9 基因表达对细粒棘球蚴 原头节 DNA 氧化损伤机制的影响
siRNA 特异性干扰 EgRad9 基因表达对细粒棘球蚴 原头节 DNA 氧化损伤机制的影响
复制标题
DOI：
--
复制
发表时间：
2018
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
王建华
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
郑璇;卢帅;赵军;吕国栋;文丽梅;李亚芬;田春艳;王建华
目的 研究小干扰 RNA （ small interfering RNA ， siRNA ） 特异性干扰 EgRad9 基因表达后对细粒棘球蚴原头节 DNA 氧化损伤机制的影响。 方法 利用电穿孔法将 EgRad9-siRNA 干扰序列和阴性对照干扰序列转染细粒棘球蚴原头节， 实验分为 EgRad9-siRNA-354 、 -614 、 -971 干扰组， 阴性对照组和空白对照组。 电转染3 d 后， 加入自然状态下原头节最大耐受浓度的 H 2 O 2 处理 1 h ， 伊红染液染色后， 倒置荧光显微镜下观察原头节活性并计算存活率。 收集各组原头节的培养液， 进行碱性磷酸酶活性的检测。 电转染 3 d 后， 加入自然状态下原头节耐受 H 2 O 2 的最大耐受浓度处理 1 h后，TRIzol 法提取总 RNA 。 实时荧光定量 PCR （ qRT-PCR ） 检测 EgRad9mRNA 的表达。 采用彗星实验检测干扰 EgRad9 基因表达后细粒棘球蚴原头节 DNA 氧化损伤情况， 活性氧 （ reactive oxygen species ， ROS ） 检 测 试剂盒检 测 干 扰 EgRad9 基 因 表 达后 细 粒 棘 球 蚴原头 节体内 ROS 的含 量 ， 采 用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。 结果 自然状态下细粒棘球蚴原头节体外耐受 H 2 O 2 的最大浓度为 0.4 mmol/L ，干预时间为 1 h ； 电穿孔法可将绿色荧光干扰序列有效的导入原头节体内， 实验组和阴性对照组的原头节体内均有明亮的绿色荧光斑点； 而空白对照组原头节体内无绿色荧光斑点。 EgRad9-siRNA-354 、 -614 、 -971 干扰组原头节的存活率分别为 （ 42.99 ± 4.03 ） % 、 （ 29.86 ± 5.87 ） % 和 （ 56.48 ± 4.64 ） % ， 初步筛选最有效干扰序列为 EgRad9-.siRNA-614 。 siRNA-354 、 -614 、 -971 干扰组碱性磷酸酶活性分别为 0.024 ± 0.001 、 0.004 ± 0.001 、 0.039 ± 0.002 ，其中 EgRad9-siRNA-614 组碱性磷酸酶活性与阴性对照组 （ 0.095 ± 0.001 ） 和空白对照组 （ 0.099 ± 0.001 ） 相比，差异均有统计学意义 （ t = 10.227 、 10.934， 均 P ＜0.01），表明该组原头节EgRad9 基因经干扰后对其活性影响最大 ， 最 有 效 干 扰 序 列 为 EgRad9-siRNA-614 。 EgRad9-siRNA-354 、 614 、 971 干 扰 组 EgRad9 mRNA 表 达 量 分 别 为0.432 ± 0.055 、 0.291 ± 0.079 、 0.612 ± 0.032 ， 其中经 EgRad9-siRNA-614 序列干扰后， EgRad9 mRNA 表达量与阴性对照组 （ 1.001 ± 0.020 ） 和空白对照组 （ 1.001 ± 0.012 ） 相比均显著下调 （ t = 7.874 、7.663 ， 均 P ＜ 0.01 ）， 可确定最有效干扰序列为 EgRad9-siRNA-614 。 相同电泳条件下， EgRad9-siRNA-614 干扰组原头节 DNA 碎片离开核向阳 极 迁 移 ， 形 成 拖 尾 ； EgRad9-siRNA-614 干 扰 组 彗 星 尾 距 OTM 值 为 13.901 ± 2.263 ， 与 阴 性 对 照 组 （ 0.074 ±0.020 ） 和 空 白对 照组 （ 0.047 ± 0.034 ） 相比， 差异有统计学意义 （ t = 12.845 、 13.251 ， 均 P ＜ 0.01 ）。 经 EgRad9-siRNA-614 序列干扰后， 原头节体内 ROS 含量为 13.024 ± 0.154 ， 与 阴 性 对 照 组 （ 2.728 ± 0.083 ） 和 空 白 对 照组 （ 2.555 ± 0.007 ） 相 比 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （ t = 9.296 、10.134 ， 均 P ＜ 0.01 ）。 结论 EgRad9 基因在细粒.棘球蚴原头节 DNA 氧化损伤过程中发挥重要作用， EgRad9-siRNA-614 干扰片段可特异性干扰 EgRad9 基因的表达， 并降低原头节修复 DNA 氧化损伤的能力。