Improved gRNA secondary structures allow editing of target sites resistant to CRISPR-Cas9 cleavage.
Improved gRNA secondary structures allow editing of target sites resistant to CRISPR-Cas9 cleavage.
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DOI：
10.1038/s41467-022-28137-7
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发表时间：
2022-01-25
影响因子：
16.6
通讯作者：
Pääbo S
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Riesenberg S;Helmbrecht N;Kanis P;Maricic T;Pääbo S
CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑的第一步是切割与 CRISPR 引导 RNA (gRNA) 中所谓的间隔序列互补的目标 DNA 序列。然而，一些 DNA 序列难以被 CRISPR-Cas9 切割，这至少部分是由于 gRNA 错误折叠造成的。为了克服这个问题，我们设计了gRNA，使其恒定部分具有高度稳定的发夹，并通过化学修饰进一步增强其稳定性。 “基因组编辑优化锁定设计”(GOLD)-gRNA 将基因组编辑效率提高了约 1000 倍（从 0.08% 到 80.5%），不同其他目标的平均效率提高了 7.4 倍。我们预计，无论间隔序列组成如何，这种改进的 gRNA 将允许进行有效的编辑，并且如果所需的基因组位点难以编辑，则该 gRNA 将特别有用。一些 DNA 序列难以被 CRISPR-Cas9 切割，部分原因是 gRNA 错误折叠。在这里，作者对 gRNA 进行了改造，以防止错误折叠，并通过化学修饰进一步增强其稳定性，无论目标序列如何，都可以进行稳健的基因组编辑。
The first step in CRISPR-Cas9-mediated genome editing is the cleavage of target DNA sequences that are complementary to so-called spacer sequences in CRISPR guide RNAs (gRNAs). However, some DNA sequences are refractory to CRISPR-Cas9 cleavage, which is at least in part due to gRNA misfolding. To overcome this problem, we have engineered gRNAs with highly stable hairpins in their constant parts and further enhanced their stability by chemical modifications. The ‘Genome-editing Optimized Locked Design’ (GOLD)-gRNA increases genome editing efficiency up to around 1000-fold (from 0.08 to 80.5%) with a mean increase across different other targets of 7.4-fold. We anticipate that this improved gRNA will allow efficient editing regardless of spacer sequence composition and will be especially useful if a desired genomic site is difficult to edit. Some DNA sequences are refractory to CRISPR-Cas9 cleavage, partially due to gRNA misfolding. Here the authors engineer gRNAs to prevent misfolding and further enhanced their stability by chemical modifications allowing robust genome editing regardless of target sequence.
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