Site-directed Mutational Analysis of Active Site Residues in the Acetate Kinase from Methanosarcina thermophila *
Site-directed Mutational Analysis of Active Site Residues in the Acetate Kinase from Methanosarcina thermophila *
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嗜热甲烷八叠球菌乙酸激酶活性位点残基的定点突变分析*
DOI：
--
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发表时间：
2001
影响因子：
4.8
通讯作者：
J. Ferry
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
R. D. Miles;P. Iyer;J. Ferry
乙酸激酶催化ATP的γ-磷酸向乙酸的镁依赖性转移。最近确定的晶体结构的thethanosarcina thermophila酶确定它作为糖激酶/Hsc 70/肌动蛋白超家族的折叠和存在的5个假定的核苷酸和金属结合基序的基础上，表征超家族的成员。这些基序中的四个的残基在M中。选择嗜热菌乙酸激酶进行位点定向置换和变体分析。Asp 148和Asn 7的替换导致变体的催化效率小于野生型酶的1%，表明这些残基对于活性是必需的。Glu 384也被发现是催化所必需的。相对于野生型，E384 A变体的半数最大活性所需的镁浓度增加了30倍，这涉及Glu 384与镁结合。的变体和结构数据的动力学分析是一致的非必需的作用，活性位点残基Ser 10，Ser 12，和Lys 14在催化。乙酸激酶的催化机制和其他糖激酶/Hsc 70/肌动蛋白超家族成员的关系的结果进行了讨论。
Acetate kinase catalyzes the magnesium-dependent transfer of the γ-phosphate of ATP to acetate. The recently determined crystal structure of theMethanosarcina thermophila enzyme identifies it as a member of the sugar kinase/Hsc70/actin superfamily based on the fold and the presence of five putative nucleotide and metal binding motifs that characterize the superfamily. Residues from four of these motifs inM. thermophila acetate kinase were selected for site-directed replacement and analysis of the variants. Replacement of Asp148 and Asn7 resulted in variants with catalytic efficiencies less than 1% of that of the wild-type enzyme, indicating that these residues are essential for activity. Glu384 was also found to be essential for catalysis. A 30-fold increase in the magnesium concentration required for half-maximal activity of the E384A variant relative to that of the wild type implicated Glu384 in magnesium binding. The kinetic analysis of variants and structural data is consistent with nonessential roles for active site residues Ser10, Ser12, and Lys14 in catalysis. The results are discussed with respect to the acetate kinase catalytic mechanism and the relationship to other sugar kinase/Hsc70/actin superfamily members.
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