去甲基化酶ALKBH5高、低表达食管鳞癌细胞株的构建
去甲基化酶ALKBH5高、低表达食管鳞癌细胞株的构建
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DOI：
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发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
蔡开灿
中科院分区：
文献类型：
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作者：
方婷晓;翟坚学;林桃燕;别亚男;肖东;蔡开灿
摘要: 目的 构建高、低表达去甲基化酶 ALKBH5 的食管鳞癌( ESCC) 细胞株。方法 将生长状态良好的人源胚胎肾细胞 293T 于培养瓶内培养，分别记为 A、B、a、b、c 组，待细胞融合 80% ～ 90% 后进行质粒转染，A 组 293T细胞转染高表达 ALKBH5 的质粒 pLV-ALKBH5，B 组 293T 细胞转染对照质粒 pLV-con，上述 2 个质粒中均带有 GFP蛋白和 Flag 标签蛋白( 用于后续感染细胞的筛选) ; a 组 293T 细胞转染低表达 ALKBH5 的质粒 pLKO-shALKBH5-1， b 组 293T 细胞转染低表达 ALKBH5 的质粒 pLKO-shALKBH5-2，c 组 293T 细胞转染对照质粒 pLKO-shSCＲ，上述 3个质粒中均带有嘌呤霉素抗性( 用于后续感染细胞的筛选) 。上述各组 293T 细胞质粒转染 72 h 后，分别收集细胞上清液，离心后分装; 用 A、B 组细胞上清液分别感染 ESCC 细胞株( Eca109 细胞和 Kyse510 细胞) ，采用流式细胞术.筛选 GFP 蛋白( + ) 的细胞待测; 用 a、b、c 组细胞上清液分别感染 ESCC 细胞株( Eca109 细胞和 TE-13 细胞) ，用嘌呤霉素筛选细胞待测。采用 qＲT-PCＲ 法和 Western blotting 法分别检测感染高、低表达 ALKBH5 上清液的 ESCC 细胞中 ALKBH5 mＲNA 和蛋白。结果 感染 A 组细胞上清液的 Eca109 细胞、Kyse510 细胞中 ALKBH5 mＲNA 和蛋白的相对表达量均显著高于感染 B 组细胞上清液的 Eca109 细胞、Kyse510 细胞( P 均 ＜ 0． 05) ，感染 a、b 组细胞上清.液的 Eca109 细胞、TE-13 细胞中 ALKBH5 mＲNA 和蛋白的相对表达量均显著低于感染 c 组细胞上清液的 Eca109细胞、TE-13 细胞( P 均 ＜ 0． 05) 。结论 成功构建高、低表达 ALKBH5 的 ESCC 细胞株，为进一步探讨 ALKBH5 在ESCC 发生发展中的作用提供了细胞模型。