Bioorthogonal fluorescent labeling of functional G-protein-coupled receptors.
Bioorthogonal fluorescent labeling of functional G-protein-coupled receptors.
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DOI：
10.1002/cbic.201402193
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发表时间：
2014-08-18
期刊：
影响因子：
3.2
通讯作者：
Huber, Thomas
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Tian, He;Naganathan, Saranga;Kazmi, Manija A.;Schwartz, Thue W.;Sakmar, Thomas P.;Huber, Thomas
需要新的方法对G蛋白偶联受体(GPCRs)和其他难以表达的膜蛋白进行定点定量荧光标记。理想情况下，荧光探针应该尽可能少地干扰天然结构和功能。我们评价了生物正交反应标记哺乳动物细胞中异源表达的受体中基因编码的对乙酰基-L苯丙氨酸或对叠氮基-L-苯丙氨酸残基。我们发现，酮基选择性试剂并不是真正的生物正交性的，可能是由于翻译后蛋白质氧化反应。相反，菌株促进的[3+2]叠氮-炔环加成(SPAAC)与二苯并环辛基(DIBO)试剂产生了与AZF-视紫红质的化学计量比偶合物，而背景反应可以忽略不计。作为一个有用的应用，我们使用Alexa488-视紫红质，通过一种新的荧光猝灭方法，测量了配体在模拟膜的双胞体中的摄取和释放动力学。
Novel methods are required for site-specific, quantitative fluorescence labeling of G protein-coupled receptors (GPCRs) and other difficult-to-express membrane proteins. Ideally, fluorescent probes should perturb native structure and function as little as possible. We evaluated bioorthogonal reactions to label genetically encoded p-acetyl-l-phenylalanine (AcF) or p-azido-l-phenylalanine (azF) residues in receptors heterologously expressed in mammalian cells. We found that keto-selective reagents were not truly bioorthogonal, possibly due to posttranslational protein oxidation reactions. In contrast, the strain-promoted [3+2] azide–alkyne cycloaddition (SpAAC) with dibenzocyclooctyne (DIBO) reagents yielded stoichiometric conjugates with azF-rhodopsin while undergoing negligible background reactions. As one useful application, we used Alexa488-rhodopsin to measure the kinetics of ligand uptake and release in membrane-mimetic bicelles using a novel fluorescence-quenching assay.
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