Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.
Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.
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DOI：
10.1016/j.ab.2016.07.027
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发表时间：
2016-10-15
影响因子：
2.9
通讯作者：
Lewis KA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ream JA;Lewis LK;Lewis KA
蛋白质和核酸之间的相互作用经常使用电泳迁移率变动测定（EMSA）进行分析。该技术通过电泳（最常用的是聚丙烯酰胺凝胶）将结合的蛋白质：核酸复合物与游离核酸分离。目前的研究利用琼脂糖凝胶电泳技术的最新进展，开发了一种新的EMSA协议，比传统的聚丙烯酰胺方法更简单，更快。琼脂糖凝胶通常在低电压（~10 V/cm）下运行，以尽量减少加热和凝胶伪影。在这项研究中，我们证明了使用琼脂糖凝胶进行的EMSA可以在高电压（≥ 20 V/cm）下使用0.5× TB（Tris-硼酸盐）缓冲液运行，允许短运行时间，同时产生高条带分辨率。对影响条带和图像质量的几个参数进行了优化，包括凝胶厚度、琼脂糖百分比和施加电压。协会的siRNA结合蛋白p19与其靶RNA的研究使用新的系统。琼脂糖凝胶和传统的聚丙烯酰胺凝胶方法在并行实验中产生了相似的表观结合常数。这里描述的新方法的一个特别的优点是，短的运行时间（5 - 10分钟）减少了结合复合物解离的机会，这是非平衡核酸结合实验中的一个重要问题。
Interactions between proteins and nucleic acids are frequently analyzed using electrophoretic mobility shift assays (EMSAs). This technique separates bound protein:nucleic acid complexes from free nucleic acids by electrophoresis, most commonly using polyacrylamide gels. The current study utilizes recent advances in agarose gel electrophoresis technology to develop a new EMSA protocol that is simpler and faster than traditional polyacrylamide methods. Agarose gels are normally run at low voltages (~10 V/cm) to minimize heating and gel artifacts. In this study we demonstrate that EMSAs performed using agarose gels can be run at high voltages (≥ 20 V/cm) with 0.5× TB (Tris-borate) buffer, allowing for short run times while simultaneously yielding high band resolution. Several parameters affecting band and image quality were optimized for the procedure, including gel thickness, agarose percentage, and applied voltage. Association of the siRNA-binding protein p19 with its target RNA was investigated using the new system. The agarose gel and conventional polyacrylamide gel methods generated similar apparent binding constants in side-by-side experiments. A particular advantage of the new approach described here is that the short run times (5 – 10 minutes) reduce opportunities for dissociation of bound complexes, an important concern in non-equilibrium nucleic acid binding experiments.
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