Fluorescent labeling of the leukocyte NADPH oxidase subunit p47(phox): evidence for amphiphile-induced conformational changes.
Fluorescent labeling of the leukocyte NADPH oxidase subunit p47(phox): evidence for amphiphile-induced conformational changes.
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白细胞 NADPH 氧化酶亚基 p47（phox）的荧光标记：两亲物诱导构象变化的证据。
DOI：
10.1006/abbi.1998.0938
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发表时间：
1998
影响因子：
3.9
通讯作者：
J. Park
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
H. Park;J. Park
中性粒细胞的白细胞NADPH氧化酶是一种膜结合酶，其使用NADPH作为电子供体催化氧产生O-2。在静息中性粒细胞中，当细胞暴露于适当的刺激时，该酶获得催化活性。在活化过程中，胞质氧化酶组分p47（phox）和p67（phox）迁移到质膜，在那里它们与细胞色素b558（一种膜整合的黄素血红素蛋白）结合，以组装活性氧化酶。氧化酶活化可以在无细胞系统中使用阴离子两亲物如十二烷基硫酸钠（SDS）或花生四烯酸作为活化剂来模拟。有人提出，胞质因子p47（phox）的蛋白质结构的构象变化可能是激活机制的重要组成部分。本研究的目的是开发一种方法来直接监测构象变化的p47（phox）处理时，与两亲性。重组p47（phox）中的半胱氨酸用巯基反应性的、环境敏感的荧光探针N，N '-二甲基-N（碘乙酰基）-N'-（7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二氮唑-4-基）亚乙基胺（IANBD）共价标记。一系列突变型p47（phox）蛋白，其中单个半胱氨酸（C98、C111、C196和C378）被丙氨酸取代，揭示了p47（phox）的所有四个半胱氨酸对IANBD具有反应性。我们发现，阴离子两亲物引起了剂量依赖性的增加，在537 nm的发射最大值从IANBD标记的p47（phox）的荧光。此外，在两亲物的存在下，观察到发射最大值的蓝移和由离子猝灭剂碘化钾猝灭的减少。这些结果表明，两亲物介导的IANBD标记的p47（phox）的荧光增加是由于白细胞NADPH氧化酶激活中所见的构象变化。我们建议，这种构象的改变导致在一个结合位点的外观，通过它p47（phox）与细胞色素b558在激活过程中相互作用。此外，重组p67（phox）或含有p22（phox）的富含脯氨酸序列的肽（残基149-162）诱导来自IANBD标记的p47（phox）的两亲物介导的荧光增强的衰减。这支持了p67（phox）和p22（phox）都影响p47（phox）构象的观点。
The leukocyte NADPH oxidase of neutrophils is a membrane-bound enzyme that catalyzes the production of O-2 from oxygen using NADPH as the electron donor. Dormant in resting neutrophils, the enzyme acquires catalytic activity when the cells are exposed to appropriate stimuli. During activation, the cytosolic oxidase components p47(phox) and p67(phox) migrate to the plasma membrane, where they associate with cytochrome b558, a membrane-integrated flavohemoprotein, to assemble the active oxidase. Oxidase activation can be mimicked in a cell-free system using an anionic amphiphile, such as sodium dodecyl sulfate (SDS) or arachidonic acid, as an activating agent. It has been proposed that conformational changes in the protein structure of cytosolic factor p47(phox) may be an important part of the activation mechanism. The purpose of the present study was to develop an approach to directly monitor conformational changes in p47(phox) when treated with amphiphiles. Cysteines in recombinant p47(phox) were covalently labeled with a sulfhydryl-reactive, environmentally sensitive, fluorescent probe N, N'-dimethyl-N(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl)ethyleneamine (IANBD). A series of mutant p47(phox) proteins in which the individual cysteine (C98, C111, C196, and C378) was replaced with alanine revealed that all four cysteines of p47(phox) are reactive to IANBD. We found that anionic amphiphiles elicited a dose-dependent increase in fluorescence at an emission maximum of 537 nm from IANBD-labeled p47(phox). Furthermore, a blue shift of emission maximum and a decrease in quenching by the ionic quencher, potassium iodide, were observed in the presence of amphiphiles. These results indicate that the amphiphile-mediated increase in fluorescence from IANBD-labeled p47(phox) is due to the conformational change as seen in the leukocyte NADPH oxidase activation. We propose that this alteration in conformation results in the appearance of a binding site through which p47(phox) interacts with cytochrome b558 during the activation process. In addition, recombinant p67(phox) or a peptide containing proline-rich sequence of p22(phox) (residues 149-162) induces the attenuation of the amphiphile-mediated enhancement of fluorescence from IANBD-labeled p47(phox). This supports the notion that both p67(phox) and p22(phox) influence the conformation of p47(phox).
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--
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