Crystal structure and activity of a de novo enzyme, ferric enterobactin esterase Syn-F4
Crystal structure and activity of a de novo enzyme, ferric enterobactin esterase Syn-F4
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肠杆菌素铁酯酶 Syn-F4 从头酶的晶体结构和活性
DOI：
10.1073/pnas.2218281120
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发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Arai, Ryoichi
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kurihara, Kodai;Umezawa, Koji;Donnelly, Ann E.;Sperling, Brendan;Liao, Guanyu;Hecht, Michael H.;Arai, Ryoichi
生产具有体外催化活性和体内生物功能的新型酶是合成生物学的一个关键目标。此前，我们报道了 Syn-F4，这是第一个满足这两个标准的从头蛋白质。 Syn-F4 水解铁载体铁肠杆菌素，Syn-F4 的表达使得大肠杆菌 (Δfes) 的不可存活菌株在铁限制培养基中生长。在这里，我们描述了 Syn-F4 的晶体结构。 Syn-F4 形成二聚体 4 螺旋束。每个单体包含两个长的 α-螺旋，Syn-F4 二聚体的环位于束的同一端（语法学）。有趣的是，Syn-F4结构的中心区域有一个穿孔。先前研究中的广泛诱变实验表明，五个残基（Glu26、His74、Arg77、Lys78 和 Arg85）对于体内酶活性至关重要。所有这些残基都位于 Syn-F4 结构中心区域的孔周围，表明具有催化二元组 (Glu26-His74) 的假定活性位点。五个残基发生突变的纯化蛋白完全无活性，支持了假定的活性位点和反应机制。铁肠杆菌素铁载体与 Syn-F4 结构结合的分子动力学和对接模拟证明了假定活性位点的动态特性。 Syn-F4 的结构和活性位点与天然肠杆菌素酯酶完全不同，从而证明从头设计的蛋白质可以利用与自然产生的结构和机制显着不同的结构和机制提供维持生命的催化活性。
Producing novel enzymes that are catalytically active in vitro and biologically functional in vivo is a key goal of synthetic biology. Previously, we reported Syn-F4, the first de novo protein that meets both criteria. Syn-F4 hydrolyzed the siderophore ferric enterobactin, and expression of Syn-F4 allowed an inviable strain ofEscherichia coli(Δfes) to grow in iron-limited medium. Here, we describe the crystal structure of Syn-F4. Syn-F4 forms a dimeric 4-helix bundle. Each monomer comprises two long α-helices, and the loops of the Syn-F4 dimer are on the same end of the bundle (syntopology). Interestingly, there is a penetrated hole in the central region of the Syn-F4 structure. Extensive mutagenesis experiments in a previous study showed that five residues (Glu26, His74, Arg77, Lys78, and Arg85) were essential for enzymatic activity in vivo. All these residues are located around the hole in the central region of the Syn-F4 structure, suggesting a putative active site with a catalytic dyad (Glu26–His74). The complete inactivity of purified proteins with mutations at the five residues supports the putative active site and reaction mechanism. Molecular dynamics and docking simulations of the ferric enterobactin siderophore binding to the Syn-F4 structure demonstrate the dynamic property of the putative active site. The structure and active site of Syn-F4 are completely different from native enterobactin esterase enzymes, thereby demonstrating that proteins designed de novo can provide life-sustaining catalytic activities using structures and mechanisms dramatically different from those that arose in nature.
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