crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus.
crRNA and tracrRNA guide Cas9-mediated DNA interference in Streptococcus thermophilus.
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DOI：
10.4161/rna.24203
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发表时间：
2013-05
期刊：
影响因子：
4.1
通讯作者：
Siksnys V
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Karvelis T;Gasiunas G;Miksys A;Barrangou R;Horvath P;Siksnys V
嗜热链球菌DGCC7710 CRISPR3-Cas系统的Cas9-crRNA复合物作为rna引导的内切酶，具有crrna引导的靶序列识别和蛋白介导的DNA切割功能。我们在这里展示了一个额外的RNA分子，tracrRNA（反式激活CRISPR RNA），与从携带嗜热链球菌DGCC7710 CRISPR3-Cas系统的异源大肠杆菌菌株中分离的Cas9蛋白共同纯化。我们提供的实验证据表明，体外和体内cas9介导的DNA干扰都需要tracrRNA。我们发现Cas9在体外特异性地促进前体crRNA （pre-crRNA）转录物和tracrRNA之间的双工形成。此外，管家RNase III有助于成熟crRNA生物发生的初级pre-crRNA-tracrRNA双工切割。然而，RNase III在处理从包含单个间隔序列的最小CRISPR阵列转录的短pre-crRNA时并不需要。最后，我们证明了体外组装的三元Cas9-crRNA-tracrRNA复合物可以切割DNA。本研究进一步明确了基于crrna的Cas9重编程的分子基础，以特异性地切割任何目标DNA序列以进行精确的基因组手术。本文建立的crRNA成熟和效应复合物组装过程将有助于进一步开发用于基因组编辑应用的Cas9可编程系统。
The Cas9-crRNA complex of the Streptococcus thermophilus DGCC7710 CRISPR3-Cas system functions as an RNA-guided endonuclease with crRNA-directed target sequence recognition and protein-mediated DNA cleavage. We show here that an additional RNA molecule, tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA), co-purifies with the Cas9 protein isolated from the heterologous E. coli strain carrying the S. thermophilus DGCC7710 CRISPR3-Cas system. We provide experimental evidence that tracrRNA is required for Cas9-mediated DNA interference both in vitro and in vivo. We show that Cas9 specifically promotes duplex formation between the precursor crRNA (pre-crRNA) transcript and tracrRNA, in vitro. Furthermore, the housekeeping RNase III contributes to primary pre-crRNA-tracrRNA duplex cleavage for mature crRNA biogenesis. RNase III, however, is not required in the processing of a short pre-crRNA transcribed from a minimal CRISPR array containing a single spacer. Finally, we show that an in vitro-assembled ternary Cas9-crRNA-tracrRNA complex cleaves DNA. This study further specifies the molecular basis for crRNA-based re-programming of Cas9 to specifically cleave any target DNA sequence for precise genome surgery. The processes for crRNA maturation and effector complex assembly established here will contribute to the further development of the Cas9 re-programmable system for genome editing applications.
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影响因子：
16
作者：
Hale, Caryn R.;Majumdar, Sonali;Elmore, Joshua;Pfister, Neil;Compton, Mark;Olson, Sara;Resch, Alissa M.;Glover, Claiborne V. C., III;Graveley, Brenton R.;Terns, Rebecca M.;Terns, Michael P.
通讯作者：
Terns, Michael P.
影响因子：
1.8
作者：
HOFACKER, IL;FONTANA, W;SCHUSTER, P
通讯作者：
SCHUSTER, P
影响因子：
56.9
作者：
Jinek, Martin;Chylinski, Krzysztof;Charpentier, Emmanuelle
通讯作者：
Charpentier, Emmanuelle
影响因子：
3.2
作者：
Deveau, Helene;Barrangou, Rodolphe;Moineau, Sylvain
通讯作者：
Moineau, Sylvain
影响因子：
11.4
作者：
Beloglazova, Natalia;Petit, Pierre;Yakunin, Alexander F.
通讯作者：
Yakunin, Alexander F.