埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用
埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用
复制标题
DOI：
10.12140/j.issn.1000-7423.2022.02.004
复制
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
吴家红
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
张霞;颜凤;牟小会;林紫敏;聂映;程金芝;商正玲;吴家红
目的克隆表达埃及伊蚊黄蛋白c (Aael-yellow-c)基因,并探讨rAael-yellow-c蛋白体外抗凝血作用。方法RT-PCR扩增Aael-yellow-c成熟肽基因,纯化后的片段与pEASY-E1载体连接,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定。0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达后,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况。比浊法观察不同浓度rAael-yellow-c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集活性影响。手工法检测不同浓度rAael-yellow-c蛋白对人血浆凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)及凝血酶时间(TT)的影响。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析,组间差异比较采用t检验。结果Aael-yellow-c基因CDS区为1 287 bp,含27个氨基酸组成的信号肽,成熟肽序列长1 200 bp,编码399个氨基酸。RT-PCR扩增获得Aael-yellow-c基因片段,大小约为1 200 bp。菌液PCR、双酶切和测序鉴定显示,pEASY-E1-Aael-yellow-c质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体形式表达;镍柱亲和层析纯化重组蛋白后获得单一条带。Western blotting结果显示,该蛋白可被His-tag抗体和抗rAael-yellow-c蛋白的兔血清多克隆抗体识别。血小板聚集抑制实验结果显示,2 083.30、416.66、83.33、16.67和3.33 nmol/L rAael-yellow-c蛋白可抑制由ADP诱导的血小板聚集,差异具有统计学意义(t = 7.09、10.39、5.39、10.54和8.93,P 0.05)。内外源凝血实验结果显示,与阴性对照组相比,0.12、1.20和12.00 µmol/L rAael-yellow-c分别作用于人血浆时,PT分别为13.63 ~14.10、13.32 ~14.38和13.55 ~16.01 s,差异无统计学意义(t = 1.33、0.63和1.00,P > 0.05); APTT分别为32.76 ~ 38.46、31.94~41.78和33.34 ~39.29 s,差异无统计学意义(t = 0.47、0.06和0.24,P > 0.05); TT分别为19.12 ~ 21.20、19.7 ~23.12和21.85 ~25.30 s,差异无统计学意义(t = 0.47、0.24和1.60,P>0.05)。结论获得的rAael-yellow-c蛋白主要通过抑制ADP诱导的血小板聚集作用帮助蚊虫吸血。