Engineering Production of a Novel Diterpene Synthase Precursor in Nicotiana benthamiana.
Engineering Production of a Novel Diterpene Synthase Precursor in Nicotiana benthamiana.
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DOI：
10.3389/fpls.2021.757186
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发表时间：
2021
影响因子：
5.6
通讯作者：
Graham IA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Forestier ECF;Brown GD;Harvey D;Larson TR;Graham IA
二萜的生物合成通常起源于叶绿体中的甲基赤四醇磷酸（MEP）途径，导致C20底物，香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）。先前的研究表明，MEP途径中负责第一步和最后一步的基因与GERANYLGERANYL焦磷酸盐合成酶（GGPPS）和CASBENE合成酶（CAS）联合过表达，对于增加benthamiana中CASBENE的通量是最佳的。当负责MEP途径最后一步的基因，4-羟基-3-甲基-2-烯基二磷酸还原酶（HDR）从这个组合中去除时，casbene仍然产生，但数量较低。在这里，我们报告了意想不到的发现，这种减少的基因组合也导致16-羟基-casbene （16-OH-casbene）的产生，与16-羟基-香叶基磷酸（16-OH-GGPP）在相同材料中的存在一致。间接证据表明，后者是由于HMBPP转化为二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）的HDR步骤中的瓶颈导致4-羟基-3-甲基-但2-烯基焦磷酸（HMBPP）水平升高而形成的。当在benthamiana中以MEP途径基因的相同还原组合短暂表达时，来自烟叶（Nicotiana attenuata, NaGLS）的GERANYLLINALOOL合成酶过表达产生16-羟基-香叶樟醇（16-OH-geranyllinalool）。这项工作强调了途径通量控制在代谢途径工程中的重要性，以及通过合成生物学增加萜烯多样性的可能性。
Diterpene biosynthesis commonly originates with the methylerythritol phosphate (MEP) pathway in chloroplasts, leading to the C20 substrate, geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP). The previous work demonstrated that over-expression of genes responsible for the first and last steps in the MEP pathway in combination with GERANYLGERANYL PYROPHOSPHATE SYNTHASE (GGPPS) and CASBENE SYNTHASE (CAS) is optimal for increasing flux through to casbene in Nicotiana benthamiana. When the gene responsible for the last step in the MEP pathway, 4-HYDROXY-3-METHYLBUT-2-ENYL DIPHOSPHATE REDUCTASE (HDR), is removed from this combination, casbene is still produced but at lower amounts. Here, we report the unexpected finding that this reduced gene combination also results in the production of 16-hydroxy-casbene (16-OH-casbene), consistent with the presence of 16-hydroxy-geranylgeranyl phosphate (16-OH-GGPP) in the same material. Indirect evidence suggests the latter is formed as a result of elevated levels of 4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) caused by a bottleneck at the HDR step responsible for conversion of HMBPP to dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP). Over-expression of a GERANYLLINALOOL SYNTHASE from Nicotiana attenuata (NaGLS) produces 16-hydroxy-geranyllinalool (16-OH-geranyllinalool) when transiently expressed with the same reduced combination of MEP pathway genes in N. benthamiana. This work highlights the importance of pathway flux control in metabolic pathway engineering and the possibility of increasing terpene diversity through synthetic biology.
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