OmniChange: the sequence independent method for simultaneous site-saturation of five codons.
OmniChange: the sequence independent method for simultaneous site-saturation of five codons.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0026222
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发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Schwaneberg U
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Dennig A;Shivange AV;Marienhagen J;Schwaneberg U
已开发出集中突变库生成方法，主要是为了改善“可定位”的酶特性，例如活性和选择性。目前的多位点饱和方法受到基因序列的限制，需要后续的 PCR 步骤和/或额外的酶促修饰。在这里，我们报告了一种多位点饱和诱变方法 OmniChange，它同时有效地使五个独立密码子饱和。作为原理证明，生成了五个化学切割的 DNA 片段，每个片段携带一个 NNK 简并密码子，并在一锅反应中组装成全基因长度，无需额外的 PCR 扩增或使用限制性酶或连接酶。测序显示在各个位置存在多达 27 个不同的密码子，相当于 NNK 简并所提供的理论多样性的 84.4%。 OmniChange 完全独立于序列，不需要突变密码子之间的最小距离，并且可以在一天内完成。
Focused mutant library generation methods have been developed to improve mainly “localizable” enzyme properties such as activity and selectivity. Current multi-site saturation methods are restricted by the gene sequence, require subsequent PCR steps and/or additional enzymatic modifications. Here we report, a multiple site saturation mutagenesis method, OmniChange, which simultaneously and efficiently saturates five independent codons. As proof of principle, five chemically cleaved DNA fragments, each carrying one NNK-degenerated codon, were generated and assembled to full gene length in a one-pot-reaction without additional PCR-amplification or use of restriction enzymes or ligases. Sequencing revealed the presence of up to 27 different codons at individual positions, corresponding to 84.4% of the theoretical diversity offered by NNK-degeneration. OmniChange is absolutely sequence independent, does not require a minimal distance between mutated codons and can be accomplished within a day.
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