Mobility shift-based electrophoresis coupled with fluorescent detection enables real-time enzyme analysis of carbohydrate sulfatase activity
Mobility shift-based electrophoresis coupled with fluorescent detection enables real-time enzyme analysis of carbohydrate sulfatase activity
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基于迁移率变化的电泳与荧光检测相结合，可以对碳水化合物硫酸酯酶活性进行实时酶分析
DOI：
10.1101/2020.12.01.406876
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发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
Byrne D
中科院分区：
文献类型：
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作者：
Byrne D
硫酸化碳水化合物代谢是一个基本的过程，它发生在生命的各个领域。碳水化合物硫酸酯酶是从碳水化合物中除去硫酸酯基团的酶，并且对于复杂多糖的解聚是必需的。尽管碳水化合物硫酸酯酶具有重要的生物学意义，但对其研究甚少，在准确评估其活性、特异性和动力学参数方面仍然存在挑战。最值得注意的是，从硫酸化底物中分离硫酸化产物目前是一个耗时的过程。在本文中，我们描述了快速毛细管电泳结合底物荧光检测作为一种高通量和简便的手段分析碳水化合物硫酸酯酶活性的发展。该方法具有实用性的动力学和抑制参数的测定，是基于现有的微流控技术耦合到一个新的合成荧光6S-GlcNAc碳水化合物基板。此外，我们比较这种技术在时间和资源方面，高效阴离子交换色谱和NMR为基础的方法，这是目前的两个“金标准”酶碳水化合物硫酸化分析。我们的研究清楚地表明了近实时的碳水化合物的纯化硫酸酯酶的定量迁移率变动分析的优点，并可以支持这些疾病相关enzymes.One句子summarySulfatases的小分子抑制剂的搜索删除硫酸基团从生物分子，在这项研究中，我们报告了一个快速和强大的毛细管电泳法碳水化合物的定量。
Sulfated carbohydrate metabolism is a fundamental process, which occurs in all domains of life. Carbohydrate sulfatases are enzymes that remove sulfate groups from carbohydrates and are essential to the depolymerisation of complex polysaccharides. Despite their biological importance, carbohydrate sulfatases are poorly studied and challenges remain in accurately assessing the activity, specificity and kinetic parameters. Most notably, separation of desulfated products from sulfated substrates is currently a time-consuming process. In this paper, we describe the development of rapid capillary electrophoresis coupled to substrate fluorescence detection as a high-throughput and facile means of analysing carbohydrate sulfatase activity. The approach has utility for the determination of both kinetic and inhibition parameters and is based on existing microfluidic technology coupled to a new synthetic fluorescent 6S-GlcNAc carbohydrate substrate. Furthermore, we compare this technique in terms of both time and resources, to high performance anion exchange chromatography and NMR-based methods, which are the two current ‘gold standards’ for enzymatic carbohydrate sulfation analysis. Our study clearly demonstrates the advantages of mobility shift assays for the quantification of near real-time carbohydrate desulfation by purified sulfatases, and could support the search for small molecule inhibitors of these disease-associated enzymes.One sentence summarySulfatases remove sulfate groups from biomolecules; in this study we report a rapid and robust capillary electrophoresis assay for the quantification of carbohydrate desulfation.
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